水中运动联合中药内治对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡和心功能的影响

黄光明，赵兴昌，符显昭

（1.右江民族医学院临床医学院，广西 百色 533000；2.右江民族医学院附属医院中医科，广西 百色 533000）

成人心肌细胞在心室区域中占比高达49%[1]，是心脏发挥泵血功能的关键细胞，而糖尿病状态下的高血糖、高血脂、氧化应激等病理因素易诱发心肌细胞过度内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），造成心肌凋亡[2]。心肌细胞凋亡将促发凋亡区域的心肌细胞与细胞外基质的一系列代偿性病理改变，导致心脏重塑发生与进展[3]。心脏重塑严重危害心脏结构与功能，是各种心血管疾病进展至心力衰竭的关键性病理改变[4]。目前临床治疗主要以降糖药物防控糖尿病及其心血管并发症进展，但无论发展中还是发达国家，糖尿病患者的心力衰竭发病率依旧居高不下[5]。因此，积极寻找减轻糖尿病下心肌细胞凋亡的有效方法，抑制心脏重塑发生与进展，对于降低糖尿病患者心力衰竭发生率意义重大。水中运动治疗是水疗康复的现代主流技术方法，可激发患者兴趣，缩减心理障碍，缓解运动不耐受，心血管康复优势明显[6，7]。中药内治是传统康复医学的重要治疗方法，越来越多的药理学研究和临床试验都证实了相关中药成分具有抗炎、抗凋亡、调节代谢紊乱等多重功效[8]。本实验拟探究水中运动联合中药内治对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡和心功能的影响，为糖尿病合并心血管疾病的防治提供借鉴和依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 链脲佐菌素（北京华越洋生物公司），血糖试纸（武汉博士德生物工程有限公司），高脂饲料（江苏省协同生物工程有限公司），TUNEL试剂盒（北京华越洋生物公司），生理盐水、PBS 缓冲液、二甲苯、乙醇溶液、过氧化氢溶液、4%多聚甲醛（成都市科隆化学品有限公司），PCR 引物及试剂（上海吉凯基因生物科技有限公司）；Vevo-770 小动物超声诊断仪，超净工作台（山东博科生物科技有限公司），-80 ℃超低温冰箱（中国海尔），光学显微镜（奥林巴斯公司），PCR 仪（Bio-Rad 公司）。

1.2 动物分组与造模 雄性SD 大鼠125 只，体重（240±10）g[购自广西医科大学实验动物中心，许可证编号SCXK（桂）2014-002]，大鼠饲养于右江民族医学院动物实验中心，环境温度（20±2）℃，相对湿度50%～60%。按照随机数字表法将其分为空白组、模型组、中药内治组、水中运动组、综合康复组，每组25 只。除空白组外，其余组空腹10 h 后，随即按照50 mg/kg 腹腔注射链脲佐菌素，72 h 后检测其空腹血糖（FBG）水平，选择连续2 次FBG≥16.7 mmol/L 大鼠,高脂饲养3 个月后作为2型糖尿病模型。造模成功后除空白组外各组继续高脂饲养（具体成分为：猪胆盐0.3%、胆固醇1.5%、猪油10%、蛋黄粉10%、普通饲料78.2%），空白组大鼠采用普通饲料喂养。实验方案严格遵守美国NIH 下的实验动物使用指南，并通过右江民族医学院实验动物伦理委员会的批准。

1.3 水中运动方案 水中运动组以及综合康复组利用自制大鼠水疗运动池进行游泳运动，水疗运动池水深不小于30 cm，维持水温32 ℃～35 ℃，每次使用前消毒，确保水质安全。每周运动6 次，第1 周为适应期，运动时间为10 min/次，第2 周为延长运动适应期，运动时间逐渐增至30 min/次，第3～8 周运动时间为60 min/次。

1.4 灌胃处理方案 将中药复方（人参、麦冬、黄芪、地黄、大黄、山茱萸、黄连、五味子，购自右江民族医学院附属医院）制成浸膏，依据人与大鼠剂量换算公式确定用药剂量，配制成混悬液后，中药内治组与综合康复组按照1.0 g/（kg·d）灌服混悬液，模型组与水中运动组每天给予等体积生理盐水灌胃处理，连续灌胃8 周,各组灌胃处理在运动前2 h 进行。

1.5 超声心动图检测 各组接受相应处理8 周后进行超声心动图检测，2%异氟烷吸入诱导麻醉大鼠，仰卧位固定，利用Vevo-770 小动物超声诊断仪检测左室舒张末期内径（LVEDD）、左室收缩末期内径（LVESD）、射血分数（EF）、二尖瓣快速充盈期与心房收缩期血流速度比值（E/A）。

1.6 实验取材 各组接受末次相应处理并进行超声心动图检测后，麻醉处死大鼠，摘取心脏，分为2 部分，一部分4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，用于TUNEL 法检测心肌细胞凋亡，另一部分存放于-80 ℃液氮保存，用于RT-PCR 实验。

1.7 TUNEL 法检测心肌细胞凋亡 利用二甲苯处理心肌组织石蜡切片10 min，脱蜡后使用乙醇溶液完成水化处理，加入蛋白酶，室温下15 min，3%过氧化氢溶液处理10 min，按照TUNEL 凋亡检测试剂盒明配制TUNEL 液；将TUNEL 液添加至切片，37 ℃下反应60 min，PBS 冲洗后添加DAB 显色剂，85%、95%、100%逐级浓度梯度乙醇脱水，二甲苯透明，最后中性树胶封片。显微镜下观察，拍照TUNEL 染色大鼠心肌细胞凋亡结果。凋亡阳性心肌细胞核为黄棕色，正常心肌细胞核呈蓝色,每张切片选择5 个不重复视野对细胞核总数和凋亡细胞核数目进行统计，并计算心肌细胞凋亡指数（cell apoptotic index，CAI）。CAI=凋亡心肌细胞核数/总细胞核数×100%，计算每个视野内的CAI，并取平均值。

1.8 Real time-PCR 测定心肌组织中葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12（Caspase-12 mRNA)转录水平 取心肌组织0.1 g，加入液氮研磨后利用Trizol 试剂提取大鼠心肌组织总RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测完整性后按照试剂盒说明书逆转录为cDNA，获取目的基因。Real time-PCR 测定GRP78、Caspase-12 mRNA 相对表达水平，反应条件为96 ℃4 min，94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，共计40 个循环。目的基因的相对表达标准化为GAPDH，各项数据使用2＿△△Ct法进行分析、计算。扩增目的基因所用引物见表1。

表1 目的基因及内参引物

1.9 统计学处理 所有数据采用SPSS 19.0 软件包进行分析，计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）,两组间比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义，P＜0.01 表示统计学意义显著。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 造模成功后，糖尿病大鼠精神萎靡，毛色暗淡，多饮、多食，体重下降。各组大鼠在饲养、灌胃、与水中运动期间进展顺利。

2.2 各组大鼠心脏重塑指标的比较 超声检测结果显示，与空白组比较，模型组大鼠LVEDD 与LVESD均增高（P＜0.05），EF 降低（P＜0.05），E/A 降低（P＜0.01）；经过8 周干预后，与模型组相比，水中运动组、中药内治组和综合康复组LVEDD、LVESD 均降低，EF 升高（P＜0.05），E/A 升高（P＜0.01）；在各治疗组中，综合康复组各项指标值改善最为明显，与水中运动组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠心脏重塑指标与心功能指标的比较（）

表2 各组大鼠心脏重塑指标与心功能指标的比较（）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与空白组比较，#P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05；与模型组比较，&P＜0.01；与水中运动组比较，○P＜0.05

2.3 各组大鼠心肌细胞凋亡CAI 的比较 光镜下TUNEL 法检测结果显示正常状态下心肌细胞核为蓝色，阳性凋亡心肌细胞核为棕黄色，细胞核发生皱缩，体积小于正常细胞核大小；与空白组比较，模型组、水中运动组、中药内治组、综合康复组心肌细胞凋亡率均升高（P＜0.01）；与模型组比较，水中运动组、中药内治组、综合康复组心肌细胞凋亡率均降低（P＜0.05）；与水中运动组比较，综合康复组心肌细胞凋亡率降低（P＜0.05），见表3、见图1。

表3 各组大鼠CAI 的比较（，%）

表3 各组大鼠CAI 的比较（，%）

注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05；与水中运动组比较，△P＜0.05

图1 各组大鼠心肌细胞凋亡情况（TUNEL，×200）

2.4 各组大鼠心肌细胞GRP78、Caspase-12 mRNA转录水平比较 与空白组比较，模型组、水中运动组、中药内治组、综合康复组大鼠Caspase-12、GRP78 的mRNA 转录水平均升高（P＜0.01）；经过8周治疗后，与模型组比较，水中运动组、中药内治组、综合康复组Caspase-12、GRP78 的mRNA 转录水平均降低（P＜0.05），与水中运动组比较，综合康复组Caspase-12、GRP78 的mRNA 转录水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 各组心肌细胞GRP78、Caspase-12 mRNA转录水平比较（）

表4 各组心肌细胞GRP78、Caspase-12 mRNA转录水平比较（）

注：与空白组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05；与水中运动组比较，△P＜0.05

3 讨论

糖尿病对心脏危害极大，是心力衰竭的独立危险因素。心肌细胞体外研究显示高血糖合并高血脂状态可显著改变心肌细胞形态与空间排列并诱发心肌细胞大量凋亡[9]，表明糖尿病可对心脏造成广泛且严重的损害。ERS 则被证明在糖尿病与心肌细胞凋亡间发挥着中介作用，借助调控ERS 对抗心肌凋亡有望成为防治糖尿病下心力衰竭的重要途径[10]。

内质网是真核细胞中处于动态平衡的囊体细胞器，负责蛋白质、脂质、类固醇的生物合成以及钙离子的平衡调控。生理或病理性应激原均可改变内质网稳态，造成未折叠或错误折叠蛋白质积累，导致ERS 的发生[11]，内质网为维持自身稳态将启动减少蛋白质合成，增加折叠能力以及促进异常蛋白清除等途径，被称之为未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）[12]。糖尿病状态下的高血糖、高血脂、氧化应激状态、炎症反应等病理因素易诱发心肌细胞持久的ERS，使蛋白激酶样内质网应激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）、活化转录因子6（activating transcription factor 6，ATF6）及肌醇需求酶1（Inositol-requiring enzyme1，IRE-1）与GRP78分离，转而与未折叠蛋白结合，激活UPR 以恢复内质网稳态，但过度的ERS 将超过心肌内质网恢复稳态的能力，PERK、ATF6、IRE-1 三者将进而激活下游的凋亡信号分子CCAAT 增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/Enhance-Binding protein Homologous protein，CHOP）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases，c-JNK）、Caspase-12，激活相应CHOP/GADD153 途径、c-JNK 途径、Caspases12 三条ERS凋亡路径，导致心肌细胞凋亡[13，14]。

本实验借助建立2型糖尿病大鼠模型探究了水中运动、中药内治和水中运动联合中药内治对糖尿病大鼠心肌细胞凋亡和心功能的干预效果。实验结果显示与空白组比较，模型组大鼠心脏重塑指标LVEDD、LVESD 增高，心功能指标EF、E/A 下降，表明实验中糖尿病大鼠心脏结构肥大，存在典型的糖尿病心脏病变，并出现心功能下降。三个治疗组经8周相应干预后，糖尿病大鼠心脏重塑和心功能均得到明显改善，且综合康复组心脏重塑和心功能改善优于单独水中运动组。有糖尿病大鼠实验表明[15]，运动训练可通过调控NADPH 氧化酶活性减轻大鼠心脏氧化应激反应，进而抑制糖尿病大鼠心脏重塑，保护心功能。杨海玉等[16]发现丹参中活性成分丹参酮可通过抑制糖尿病大鼠心肌中NF-κB 通路，减轻炎症反应，对糖尿病大鼠心肌提供保护。上官若男等[17]的研究表明，游泳运动干预后糖尿病大鼠心室肥厚和心肌纤维化病变得到明显改善。本实验结果提示水中运动和中药内治均具有缩小心脏肥大性改变、增强心肌收缩力、提升心脏射血功能的作用，与任磊等[18]的研究结果相似。研究表明[19]，糖尿病患者和糖尿病动物模型心脏中均可发现心肌细胞凋亡增加。本实验中心肌组织TUNEL 染色结果同样显示，糖尿病大鼠心肌细胞凋亡水平显著升高，由于心肌细胞无增殖能力，凋亡后将直接影响心脏收缩与舒张，符合本实验中观察到的糖尿病大鼠心功能下降现象。符显昭等[20]应用人参、麦冬、丹参、五味子、黄芪等配伍成中药复方，可有效降低糖尿病大鼠心肌细胞凋亡水平。邓爽等[21]研究发现，4 周游泳运动预适应可减少促凋亡因子表达，抑制心肌细胞凋亡，改善心肌重构模型小鼠心功能，延缓心力衰竭进展。在本实验中发现水中运动与中药内治均可减少糖尿病大鼠心肌细胞凋亡，两者联合下的综合康复组心肌凋亡和心功能改善最佳。实验进一步对其可能的作用机制进行了探究，通过对各组实验大鼠心肌组织ERS 标志分子GRP78、Caspase-12 的mRNA 转录水平比较分析发现糖尿病模型大鼠内质网应激水平显著升高，而三种康复治疗方法均能明显降低心肌细胞GRP78、Caspase-12 的mRNA 转录水平，提示各治疗组心肌细胞凋亡水平的下降与抑制过度ERS所激活的Caspase-12 凋亡通路有关，这与金娟等[22]和常盼等[23]所报道的抑制ERS 凋亡通路，可降低心肌细胞凋亡水平的发现相符。另外，据相关临床线性回归分析报道内质网应激标志物GRP78 可协助诊断心力衰竭，评估心衰患者病情预后[24]。本实验中水中运动组、中药内治组和综合康复组的糖尿病大鼠经8 周相应治疗后心肌细胞GRP78 mRNA 转录水平相对模型组大鼠明显降低，提示上述三种康复治疗方法具有改善心力衰竭预后的潜在临床应用价值。

综上所述，细胞凋亡是糖尿病下心肌细胞发生过度内质网应激时的主要结局之一，心脏重塑则是大量心肌细胞因凋亡而丢失后的必然结果，减少心肌细胞凋亡可保护糖尿病患者心功能，降低其心力衰竭发生风险，本研究发现水中运动联合中药内治下的综合康复治疗可有效抑制糖尿病下心脏重塑，提升心功能，其机制与减轻心肌细胞过度内质网应激，抑制Caspase-12 凋亡通路有关。