山茱萸多糖提取工艺优化及对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

任俊鹏，杨志萍，陈贵堂，綦国红

中国药科大学工学院/国家中药材加工技术研发专业中心（南京 211198）

中药中常用的山茱萸是山茱萸科植物山茱萸（Cornus officinalisSieb.et Zucc.）的干燥成熟果肉，又名药枣、萸肉、山萸肉等，主要来自我国中部，如山西、河南、湖南等省份，具有补益肝肾、收涩固脱等作用[1]，中医中常用于治疗糖尿病、癌症和休克等疾病，含有多糖、三萜、环烯醚萜、有机酸、黄酮和鞣质等成分。近几年对山茱萸多糖的研究主要集中在提取分离和药理活性方面。山茱萸多糖提取分离常用方法是热水提取法，此方法时间长，能耗高，提取率低。超声提取法，利用超声波产生的空化、振动、粉碎、搅拌等效应破坏细胞壁，增加溶剂穿透力，提高提取率，缩短提取时间[2]。

糖尿病（diabetes mellitus，DM）成为严重威胁人类健康的慢性疾病之一[3]，患者多以注射胰岛素和长期服用降血糖药物来控制血糖。α-葡萄糖苷酶存在于人体小肠黏膜细胞中，参与人体糖代谢，使碳水化合物分解为易于被人体吸收的单糖，能够导致糖尿病患者餐后血糖上升。α-葡萄糖苷酶抑制剂通过竞争性抑制α-葡萄糖苷酶活性，使碳水化合物缓慢分解为葡萄糖，从而控制糖尿病患者餐后血糖水平。α-葡萄糖苷酶抑制剂是糖尿病人的临床用药，多以化学合成或微生物发酵法获得，虽有良好的药效，但长期服用毒副作用明显[4]。因此寻找天然来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂将成为今后糖尿病治疗的新思路。试验在超声辅助提取山茱萸多糖工艺优化的基础上，进一步探究山茱萸多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，考察其降血糖活性的潜质。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山茱萸，产地安徽亳州，于60 ℃烘干8 h，粉碎，过0.180 mm（80目）筛，于-4 ℃密封保存备用。

D-无水葡萄糖（上海凛恩科技发展有限公司）；苯酚（上海晶纯生化科技股份有限公司）；98%硫酸（南京化学试剂股份有限公司）；α-葡萄糖苷酶（上海源叶生物科技有限公司）；阿卡波糖（上海源叶生物科技有限公司）；对硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（PNPG，北京伊诺凯科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

TU-1901型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；RE-5205型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；JY-92IIN型超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Elx800多功能酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 山茱萸粗多糖提取工艺流程

一定质量的山茱萸粉与蒸馏水按一定比例的料液比置于250 mL锥形瓶中超声，冷却后离心（4000 r/min，10 min），取上清液，定容至250 mL，即为待测液。将待测液浓缩2.5倍，按1∶4（V浓缩待测液∶V无水乙醇）加乙醇沉淀多糖，离心（4000 r/min，10 min），取沉淀，于-50 ℃真空干燥，得到山茱萸粗多糖[5-6]。

1.3.2 标准曲线的绘制

按照文献[5]方法以葡萄糖溶液的质量浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=0.0105X+0.052和相关系数R2=0.9991。

1.3.3 山茱萸粗多糖提取率的测定

按1.3.2法进行测定，将吸光度带入回归方程，得待测液中多糖质量浓度，计算多糖质量，按式（1）计算山茱萸多糖提取率。

式中：A为待测液吸光度；0.052为标准曲线截距；0.010 5为标准曲线斜率；10为待测液稀释倍数；0.25为待测液体积，L；3为山茱萸原料质量，g。

1.3.4 山茱萸粗多糖提取单因素试验

1.3.4.1 超声提取温度对提取率的影响

取3.0 g山茱萸样品，加90 mL蒸馏水，恒定超声时间、超声功率和料液比，测定温度分别为40，50，60，70和80 ℃时山茱萸粗多糖的提取率[5-6]。

1.3.4.2 超声提取功率对提取率的影响

取3.0 g山茱萸样品，加90 mL蒸馏水，恒定超声时间、超声温度和料液比，测定功率分别为400，425，450，475和500 W时山茱萸粗多糖的提取率。

1.3.4.3 超声提取时间对提取率的影响

取3.0 g山茱萸样品，加90 mL蒸馏水，恒定超声功率、超声温度和料液比，测定超声时间分别为20，30，40，50和60 min时山茱萸粗多糖的提取率[5-6]。

1.3.4.4 超声提取料液比对提取率的影响

取3.0 g山茱萸样品，恒定超声功率、超声温度和超声时间，测定料液比分别为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL）时山茱萸粗多糖的提取率。

1.3.5 山茱萸粗多糖提取正交试验

在4个单因素试验基础上，从每个单因素的5个水平中选取3个水平。以粗多糖提取率（%）为考察指标，采用四因素三水平的正交试验，按照L9(34)标准正交表进行正交试验设计，优化山茱萸粗多糖的提取工艺条件。

1.3.6 山茱萸粗多糖提取的验证试验

分别称取3份3.0 g山茱萸样品，按照正交设计试验得出的超声提取的最佳工艺条件，进行提取并计算粗多糖提取率。

1.3.7 山茱萸粗多糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

按文献[7]方法，磷酸缓冲液（PBS）pH6.8，α-葡萄糖苷酶浓度0.2 U/mL，底物（PNPG）浓度10 mmol/mL，Na2CO3浓度1 mol/L。加入底物前于37 ℃反应20 min，加入底物后于37 ℃反应40 min，最后加入Na2CO3溶液终止反应，反应步骤如表1所示。

表1 PNPG法测α-葡萄糖苷酶活性步骤参数

反应结束后于410 nm波长酶标仪测定吸光度，山茱萸粗多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率按式（2）计算。

2 结果与分析

2.1 山茱萸粗多糖提取单因素试验结果

2.1.1 超声提取温度的确定

如图1所示，超声温度对提取率影响较大，温度40～70 ℃范围内多糖提取率随温度升高而增加，超声温度大于60 ℃时提取率增长变缓，70 ℃时达到最高，提取温度大于70 ℃时提取率呈现下降趋势。因此，最佳提取温度为70 ℃。

图1 超声提取温度对山茱萸粗多糖提取率的影响

2.1.2 超声提取功率的确定

如图2所示，超声功率400～475 W范围内，粗多糖提取率随提取功率升高而增大，在475 W时提取率达到最高，然后提取率随提取功率升高而略有下降。分析其原因：随着超声功率升高，超声波带来的空化作用越来越大，增加山茱萸细胞壁的破坏程度，使细胞内物质渗出加快，山茱萸多糖提取率增大。超声功率大于475 W时，空化作用增强使杂质含量增加，多糖提取率变化不大，而且功率越大能耗越高。综合考虑，提取功率选择475 W。

图2 超声提取功率对山茱萸粗多糖提取率的影响

2.1.3 超声提取时间的确定

如图3所示，超声时间10～50 min时，随时间延长细胞破碎程度增大，多糖提取率随之增大，并在50 min时达到最大值，提取时间超过50 min时，随时间延长粗多糖提取率略有下降。综合考虑，提取时间选择50 min。

图3 超声提取时间对山茱萸粗多糖提取率的影响

2.1.4 料液比的确定

如图4所示，料液比1∶10～1∶30 g/mL时山茱萸粗多糖提取率呈上升趋势，料液比1∶30 g/mL时，提取率达最大。随料液比中液体比例的增加，提取率呈现下降趋势。料液比中液体比例较大时，溶质溶出较快，同时可能导致溶出杂质较多，所以提取率出现波动。同时料液比中液体比例增大会增加浓缩时间与能耗，综合考虑，最佳料液比为1∶30 g/mL。

图4 料液比对山茱萸粗多糖提取率的影响

2.2 正交试验与结果

在单因素试验的基础上，以粗多糖提取率（%）为考察指标，选取超声温度（A）、超声功率（B）、超声时间（C）、料液比（D）4个因素，每个因素3个水平，按照L9(34)标准正交表进行正交试验设计。正交试验因素及水平如表2所示，试验结果见表3。

表2 正交试验因素及水平

根据表3中R值（极差）可知，试验考察的影响山茱萸多糖提取率的各因素的次序为A＞B＞D＞C，其中A较为显著，B、D和C为一般显著性水平。通过对表3中K1、K2、K3分析可知，山茱萸粗多糖提取的最佳工艺条件是A1B1C3D2，即超声温度60 ℃、超声功率450 W、超声时间50 min、料液比1∶30 g/mL。

表3 正交试验设计及结果

2.3 重现性试验

根据正交试验确定的最佳提取工艺条件，即超声温度60 ℃、超声功率450 W、超声时间50 min、料液比1∶30（g/mL），进行3次平行试验，试验结果分别为30.36%，30.45%和30.48%，平均值为30.43%，相对标准偏差（SRSD）为0.21%，试验重现性良好，该提取条件对山茱萸粗多糖的提取效果较好。

2.4 山茱萸粗多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

由图4可知，山茱萸粗多糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用呈量效关系，10 mg/mL时抑制率达70%，说明山茱萸多糖可以有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，具有降血糖的潜质。

图5 山茱萸粗多糖、阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

3 结论与讨论

通过单因素试验和正交试验，对山茱萸粗多糖的超声提取工艺进行优化，确定最佳提取条件：超声温度60 ℃、超声功率450 W、超声时间50 min、料液比1∶30（g/mL），并在此条件下进行验证试验，山茱萸粗多糖提取率达30.43%。该提取工艺时间短，提取率较高，耗能较少。研究表明，不同的提取方法不但影响多糖的提取效率，而且影响多糖的分子量、单糖组成、结构以及生物活性。在多糖提取中，不同提取方法对同种原料产生效果不同，而超声辅助提取山茱萸粗多糖，对结构和活性的改变仍有待研究。糖尿病患者餐后血糖升高可以通过服用α-葡萄糖苷酶的抑制剂进行控制，阿卡波糖是α-葡萄糖苷酶的抑制剂，临床上常用于治疗2型糖尿病导致的餐后血糖升高。对α-葡萄糖苷酶活性的抑制试验表明山茱萸粗多糖对α-葡萄糖苷酶活性具有较好的抑制作用，10 mg/mL时抑制率达70%，是同浓度下阿卡波糖的79%，为其在降血糖活性方面的应用提供理论依据。