嘧啶酮衍生物和牛血清白蛋白的荧光光谱研究*

高晓培，陈思远，闵梦娇，黄毅哲，张国生，路东亮,†，黄书娟

(1.赣南师范大学 化学化工学院，江西省高等学校功能材料化学重点实验室；2.赣南医学院，江西 赣州 341000)

嘧啶酮属于含氮杂环化合物，其衍生物有着抗病毒、抗癌(图1a)、抗炎(图1b)、抗菌等广泛的药理活性和生物活性[1-3]，同时嘧啶酮衍生物也是一种十分重要的药物中间体.近几年科学工作者对其进行了许多的研究，发现嘧啶酮衍生物更多的生物和药理作用，某些多官能团的嘧啶酮衍生物还被用作钙通道阻滞剂、抗高血压剂、拮抗剂、抗氧化剂、抗肿瘤药、抗炎和抗结核等药物[4].由于嘧啶酮衍生物在各个方面的良好表现，近几年已经成为含氮杂环化合物的研究热点.

图1 具有生物活性的嘧啶酮衍生物

在人体及动物的所有蛋白质当中，科学工作者对血清白蛋白的研究最为广泛和清晰.血清白蛋白占血浆中所有球状蛋白的60%，在血浆中含量十分丰富，且提供近80%的渗透压.除此之外，血清白蛋白还可以供给营养、缓冲pH值和运输载体等[5-6].牛血清白蛋白(BSA)与人血清蛋白(HSA)的结构和氨基酸序列非常相似，并且BSA更容易获取，所以通常在与小分子药物相互作用的研究中，选择BSA作为模型蛋白.BSA中含有583个氨基酸残基，而在本实验中发挥主要作用的只有两种色氨酸(Trypt-ophan，Trp)，即Trp-314和Trp-213[7].

本文在课题组前期工作的基础上，选择4种不同取代基的嘧啶酮衍生物，研究其与BSA的相互作用，进一步加深人们对嘧啶酮衍生物在体内的分布、转运机制的理解，为开发嘧啶酮类新药及研究嘧啶酮药物对人体的作用提供一定的理论依据.同时，通过本实验可以探究嘧啶酮骨架的结构改造和性能，并研究其对血清白蛋白的结构功能的影响.

1 实验部分

1.1 主要仪器

涡旋混匀器(Vortex Mixer v8, 上海凌仪实业有限公司)；pH计(Sartorius Basic pH Meter PB-10,上海人和科学仪器有限公司)；真空干燥箱(DZF-6020，郑州宝晶科技有限公司)；电子天平(CP114, 常州有限公司)；荧光发光分光光度仪光谱仪(Perkin Elmer Ls 55).

1.2 主要试剂

主要试剂：实验室已有的d1、d2、d3、d4四种嘧啶酮衍生物，结构如图2.

图2 4种嘧啶酮衍生物结构

其他试剂：二甲亚砜(DMSO)(分析纯)；牛血清白蛋白(BSA)(Fraction V)；处理方法为标准方法.

1.3 实验方法

2 结果与讨论

2.1 化合物猝灭BSA荧光图

通过荧光光谱法，得到化合物d1至d4在298 K和308 K下对BSA荧光猝灭效果，分别如图3、图4所示(注：图3和图4中，BSA的荧光强度随加入的化合物浓度增大而减小.序号1至11表示化合物浓度与BSA浓度之比为0、1、2、3、4、5、6、7、8、10及不加入BSA溶液时的荧光强度).

图3 化合物d1至d4在298 K下对BSA荧光猝灭的图

图4 化合物d1至d4在308 K下对BSA荧光猝灭的图

由图3、图4可知，在298 K和308 K两种温度下，我们发现BSA的荧光强度与化合物浓度存在关系，进一步分析发现：化合物浓度增大时，BSA的荧光强度会有规律的减弱，说明化合物分子与BSA之间的确存在着相互作用.对比d1-d4在10倍于BSA的浓度下，我们发现在308 K温度时对BSA荧光猝灭效果比其在298 K时的效果更好，对比化合物d1-d4发现，化合物d1对荧光的猝灭效果优于其他3个化合物，而化合物d3对荧光的猝灭效果最弱.

2.2 化合物与BSA作用机制的研究

通过stern-volmer方程，可以计算出化合物d1至d4在298 K和308 K下与BSA作用的Ksv(Stern-Volmer猝灭常数)，以化合物浓度Q为横坐标， F0/F为纵坐标(F和F0分别为有/没有猝灭剂存在时的荧光强度)，得到的标准曲线图如下所示(图5).

图5 化合物d1-d4在298 K和308 K的stern-volmer方程标准曲线图

通过stern-volmer方程和Ksv=KQ×τ0公式计算可得到化合物d1至d4猝灭BSA荧光的Ksv值与速率常数KQ，如表1所示：

表1 化合物d1-d4猝灭BSA荧光的Ksv值和速率常数KQ

由图表1得知，化合物d1至d4在298 K及308 K 2种温度下猝灭BSA荧光的速率常数KQ在数值上远大于2×1010L/mol·s.故化合物d1至d4在两个温度下猝灭BSA荧光的猝灭类型是静态猝灭，即化合物与BSA间形成了复合物，从而导致BSA的荧光猝灭[8].针对静态猝灭，我们使用方程lg[(F0-F)/F]=lgKa+nlgQ可以求出d1至d4在298 K和308 K下与BSA的结合常数Ka和结合位点数n.通过画图，以lgQ为横坐标，lg(F0-F)/F为纵坐标，得到的标准曲线如图所示(图6).

图6 化合物d1至d4在298 K、308 K下与BSA结合的方程图

化合物d1至d4在298 K和308 K与BSA的结合常数的对数lgKa和结合位点数n如表2所示.

表2 化合物d1至d4与BSA的结合常数和结合位点数

分析表2可知，化合物d1至d4与BSA的结合常数Ka几乎都大于105，与BSA的结合位点数n约为1，由此可知化合物d1至d4均与BSA有着相当好的结合能力[9].

利用van't Hoff公式和热力学公式可计算出化合物d1至d4在298 K与308 K下和BSA作用的热力学常数，如表3所示.

表3 化合物d1至d4猝灭BSA的热力学常数

由表3可知，化合物d1至d4与BSA结合的热力学常数△G<0，故化合物与BSA的结合过程是自发进行.表中还显示部分反应的△H>0，部分反应△H<0，可知杂合体药物与BSA作用有些是吸热反应，有些是放热反应，但放热反应和吸热反应与药物分子的结构间无特殊规律，其绝对值与分子结构间也无特殊规律.有部分药物分子与BSA作用的△S>0，另一部分△S<0，可知熵减反应和熵增反应与药物分子的结构和取代基的类型间无特殊规律，且绝对值大小与分子的结构和取代基的类型间也无特殊关系.

3 总结

本文通过荧光光谱法分别对4种嘧啶酮衍生物与BSA的相互作用进行了研究.对荧光光谱图进行数据分析，结果表明：实验研究的4种嘧啶酮衍生物都能使BSA猝灭，猝灭类型为静态猝灭，并且嘧啶酮衍生物与BSA都有着很好的结合能力，结合位点数约为 1，△G值小于0，说明化合物与BSA的结合是自发的.其中△S和△ H 大于 0,说明化合物 d1,d4与BSA结合以疏水作用力占主导；△S和△H小于0，说明化合物d2,d3与BSA结合以氢键或范德华作用力占主导.