酮型广藿香MVA途径基因表达分析及与 主要成分合成相关性研究

康大力　胡伟明　欧阳蒲月

摘要：  广藿香药材以广藿香酮含量较高的酮型广藿香为最优质。而广藿香酮为一种萜类成分，其生物合成途径尚未明确。MVA（甲羟戊酸）途径是萜类化合物生物合成的重要途径。为了分析MVA途经基因表达与化学成分的相关性从而获得促进广藿香酮合成的潜在基因，该文以2种酮型广藿香栽培品种（石牌广藿香、高要广藿香）为材料，通过实时定量PCR分析基因表达和主要成分含量测定，并研究了供试材料不同时期的茎、叶中与甲羟戊酸代谢途径相关的HMGR、MK、MDD基因表达及化学成分。结果表明：（1）HMGR基因在石牌广藿香嫩叶中表达更明显; MK基因在石牌广藿香和高要广藿香中表达模式相似，主要在老茎中表达;MDD基因在石牌广藿香叶中比高要广藿香表达量更高，在两种广藿香的茎中表达模式相似。（2）同属于酮型广藿香，石牌广藿香与高要广藿香的化學成分相似，老叶广藿香醇含量最高，老茎的广藿香酮含量更高。（3）MDD和MK基因与广藿香酮的合成正相关。综上结果所述，酮型广藿香两个栽培种MVA途径的基因表达模式相似，MDD和MK基因可能为酮型广藿香萜类代谢途径的关键基因。

关键词： 广藿香，  MVA途径， 广藿香酮， MDD基因， MK基因

中图分类号：  Q943文献标识码：  A文章编号：  1000-3142（2022）05-0745-08

Gene expression analysis of MVA pathway in Pogostemon

cablin and its correlation with synthesis of main components

Abstract：  Among all the Pogostemon cablin medicinal materials， the pogostonetype one with higher content of pogostone is regarded the best. However， as a terpenoid component， the biosynthesis of pogostone is still not clear. MVA （cytoplasmic） pathway is an important pathway for terpenoid biosynthesis. In order to clarify the correlation between chemicals and related gene expression， in this study， the gene expression of HMGR， MK and MDD of cytoplasmic pathway and the chemical components in stems and leaves of two pogostonetype P. cablin cultivars （Shipai and Gaoyao） were studied， by using real time quantitative PCR to analyze gene expression and main components measurement. The results were as follows： （1） HMGR gene was more obviously expressed in the tender leaves of Shipai cultivar. The expression pattern of MK gene in Shipai cultivar and Gaoyao cultivar was similar， and MK gene was mainly expressed in old stems. MDD gene was more expressed in Shipai cultivar leaves than that of Gaoyao cultivar， but was expressed in similar patterns in the stems of Shipai cultivar and Gaoyao cultivar. （2） Both belonging to pogostonetype P. cablin， Shipai cultivar and Gaoyao cultivar had similar chemical components. Old leaves had the highest patchoulol content and old stems had the highest pogostone content. （3） MDD and MK genes were positively related to the synthesis of pogostone， which will lay a foundation for exploring key genes in P. cablin terpenoid metabolism pathway. In conclusion， the gene expression patterns of MVA pathway in two P. cablin cultivars are similar， and MDD and MK genes may be the key genes of terpenoid metabolism pathway in P. cablin.

Key words： Pogostemon cablin， MVA pathway， pogostone， MDD gene， MK geneC657C382-18B4-494A-8042-F7973D3AA0B0

广藿香（Pogostemon cablin） 为唇形科刺蕊草属植物，以全草入药（国家药典委员会，2020），为芳香化湿药，是“藿香正气散”、“抗病毒口服液”、“保济丸”等中成药的主要成分，也是香料、化妆品等的主要原料之一。广藿香在新型冠状病毒肺炎诊疗中也发挥了重大作用，在5种相关证的治疗方案中有所应用（国家卫生健康委员会和国家中医药管理局，2020）。广藿香挥发油的主要成分为萜类化合物（陈赫等，2018）。萜类化合物主要通过甲羟戊酸（mevalonate， MVA）途径和甲基赤藓醇4磷酸（methylerythritol 4phosphate， MEP）途径合成（Yu & Utsumi， 2009），其中MVA途径也称为细胞质途径，MEP也称为质体途径（Lichtenthaler， 2015）。通常，MVA途径产生倍半萜，而MEP途徑将前体提供给半萜类、单萜类和二萜类成分。萜类合成途径中的多种合成酶是MVA和MEP途径代谢调控的重要靶点（Hemmerlin， 2012）。在MVA途径中，三个乙酰辅酶A分子和一个3羟基3甲基戊二酰辅酶A分子最初聚集，然后中间分子参与由羟基3甲基戊二酰辅酶A合成酶（HMGS，EC 2.3.3.10）和3羟基3甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR，EC 1.1.1.34）催化的反应。甲羟戊酸激酶（MVK，EC 2.7.1.36）、磷酸羟戊酸激酶（PMK，EC 2.7.4.2）和甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（MDDEC，EC 4.1.1.33）形成IPP（异戊烯焦磷酸）。之后由法尼基二磷酸合成酶（FPPS，EC 2.5.1.10）催化胞质IPP和DMAPP（二甲基烯丙基焦磷酸）的凝聚，形成倍半萜的中间体（图1）。

随着转录组测序和全基因组测序的兴起，对广藿香醇的生物合成途径研究逐渐增多。Nath（2010）从广藿香转录组文库中发掘到74个萜类生物合成相关基因，并检测其在广藿香叶、茎和花中的表达，检测了倍半萜生物合成途径中与广藿香醇合成有关酶的活性。此外，还有研究从广藿香中克隆到了倍半萜MEP途径的限速酶HMGR的cDNA，并做了生物信息学分析及在大肠杆菌（Escherichia coli）中的表达（Yu & Utsumi， 2009）。

广藿香属于十大岭南特色“广药”，也是“粤八味”之一。由于地理条件的差别，不同产地的广藿香具有不同的形态特征和挥发油含量。广藿香药材商品按产地主要分为石牌广藿香、高要广藿香、湛江广藿香、海南广藿香四种（徐颂军等，2003）。根据广藿香酮（pogostone）和广藿香醇（patchoulol）相对含量可将广藿香药材分成醇型广藿香和酮型广藿香。醇型广藿香包括湛江广藿香、海南广藿香;酮型广藿香则包括石牌广藿香、高要广藿香。石牌广藿香原产于广州石牌一带，传统认为，石牌广藿香为广藿香的道地品种，质量最优。但随着城市化的进程，市场上石牌广藿香已十分少见，逐渐被高要广藿香所取代。广藿香酮已被证明具有多种功能，包括抗胃溃疡（Chen et al.， 2015）、阻止增殖（Su et al.， 2015）和抗菌活性（Yi et al.， 2013）等。因此，与醇型广藿香主要应用于化妆品和香料行业不同，酮型广藿香更多被应用于中医药领域。

广藿香酮属于萜类物质衍生物，MVA是通路萜类物质的上游合成代谢途径，茎和叶是广藿香药材的主要取材组织部位。因此，明确代谢途径基因的时空表达模式，不同生长时期茎叶的有效成分含量以及与基因表达的相关性，对于阐明广藿香酮在高要广藿香和石牌广藿香中的合成途径和提高药材质量具有重要意义，是有效利用广藿香的重要前提。作者前期的研究中，已经将两种醇型广藿香（海南广藿香和印尼广藿香）进行了萜类代谢途径表达分析（Ouyang et al.， 2016），研究结果显示两种醇型广藿香不同部位不同生长阶段的萜类代谢相关基因表达类似，挖掘了广藿香醇合成相关候选基因，为醇型广藿香的应用提供了基础。目前，在石牌广藿香和高要广藿香的萜类代谢途径及叶、茎部分的表达差异比较方面还是空白。对萜类代谢途径进行表达分析，能够对酮型广藿香和醇型广藿香的差异提供分子基础。同时，将基因表达与成分含量进行相关性分析，可发掘提高有效成分含量的潜在基因。对酮型广藿香两个栽培种的代谢途径及各部位的挥发油含量及成分进行比较，也可促进对广藿香药材种质资源的有效评估。

1材料与方法

1.1 植物材料

石牌广藿香和高要广藿香采自于广州天河龙洞岭南中药园广藿香种植地（113°22′ E， 23°12′ N，海拔39 m）。由广东食品药品职业学院莫小路教授鉴定。取两个品种的幼叶进行全长基因的克隆。实时定量PCR（RTqPCR）分析材料根据叶片的大小及叶在茎上的位置将广藿香的叶和茎分为三个时期（Yu et al.， 2015）（图2）：嫩叶（茎顶端刚出来的第一对叶）;成熟叶（第四至第五个节叶）;老叶;嫩茎（茎顶端）;成熟茎（未木质化）;老茎（木质化）。每个样品采集约1 g，在液氮中冷冻，在-80 ℃保存。

1.2 RNA提取和RTqPCR分析

按照文献（Ouyang et al.， 2016）的方法进行。在对RNA的质量和完整性进行检查后，将高质量的RNA用于基因分离或基因表达的测定。RTqPCR方法如文献所述（Ouyang et al.， 2016），每个反应重复三次。RTqPCR引物见表1，数据以三个生物重复的平均值±标准差表示。根据文献（Livak & Schmittgen， 2001）计算基因表达水平。

1.3 化学试剂

广藿香酮对照品（批号：G055180710， 成都

瑞芬思生物科技有限公司）;广藿香醇对照品（批号：B037180122，成都瑞芬思生物科技有限公司）;正十八烷（SIGMA公司）;乙腈色谱纯（德国默克公司）;甲酸（德国默克公司）;无水乙醇、乙醚、甲醇、无水硫酸钠等试剂均为分析纯。C657C382-18B4-494A-8042-F7973D3AA0B0

1.4 仪器设备

Agileng1200高效液相色谱仪（包括四元梯度泵、自动进样器、PDA检测器、在线脱气机，美国安捷伦公司）;Agilent7892A/5975C型气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦公司）;色谱柱为HP5石英毛细管柱（0.25 μm × 30.0 m × 250 μm）;BT 125D十万分之一分析天平（德国赛多利斯）;超纯水为milliQ超纯水机制备（美国Millipore公司）;挥发油提取器;水分测定仪。

1.5 广藿香化学成分的分析

1.5.1 挥发油的提取采集石牌广藿香与高要广藿香成熟茎、老茎、成熟叶、老叶（石牌广藿香与高要广藿香的嫩茎及嫩叶挥发油含量太低，无法提取，本研究不进行这两个时期的数据测定）。样品放至通风处室温阴干，切成1～2 cm的小段，备用。取干燥的广藿香药材200 g，置于5 000 mL圆底烧瓶中，加3 000 mL蒸馏水浸泡1 h后开始提取。提取方法见《中国药典》（国家药典委员会，2020）通则2204项规定方法（甲法）。

1.5.2 广藿香醇含量测定对照品溶液及供试品溶液的制备：均按文献（陈瑜珍等，2020）的方法进行。气相色谱条件：初始温度180 ℃，停留2 min，以每5℃的速率升温至230 ℃;进样口温度280 ℃，辅助温度280 ℃，分流进样，分流比为10∶1。离子源温度为230 ℃，四级杆温度150 ℃，全扫描方式，NIST14.1质谱库挥发油中广藿香醇GCMS分析（图3）。

1.5.3 广藿香酮含量测定对照品溶液、供试品溶液制备：均按文献（陈瑜珍等，2020）的方法进行。色谱条件色谱柱：Phenomenex，Gemini 5 μ C18（250 mm × 4.60 mm）。流动相为乙腈-0.2%甲酸水溶液（65%∶35%），等度洗脱，流速0.8 μg·min1，柱温30 ℃，检测波长310 nm，进样体积10 μL。运行时间15 min，色谱图见图4。线性关系考察：按照色谱条件，精密吸取不同浓度广藿香酮标准品溶液10 μL，注入HPLC色谱仪，检测峰面积，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归（图5），回归方程为Y=18.35X-47.19，R2=0.999 9，线性范围为6.25～200 μg·mL1。稳定性试验：取配制好的供试品溶液任一种，制备后在不同时间对样品按色谱条件进样分析，共分析6次（制备后2、4、6、8、12、24 h），测定广藿香酮峰面积，结果表明相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.05%，表明供试品溶液在24 h内是稳定的。精密度实验：取50 μg·mL1对照品溶液，按色谱条件测定，连续进样6次，测定峰面积，广藿香酮峰面积的RSD为0.63%，表明高效液相色谱这套仪器的精密度良好，实验数据可信。重复性试验：取同一批广藿香油6份，每份0.15 g，精密称定，按照步骤2方法配制后，按色谱条件测定。结果，样品中广藿香酮峰面积的RSD为0.86%，表明该方法的重复性良好。数据分析方法：挥发油含量分析均使用LSD法進行多重比较;R 3.6软件以及agricolae包进行统计分析。

2结果与分析

2.1 酮型广藿香萜类代谢MVA途径中HGMR、MK、MDD基因在茎叶不同时期的表达

为了比较石牌广藿香和高要广藿香次生代谢相关基因的时空表达模式，本研究对MVA途径中三个关键酶基因（HGMR、MK、MDD）在叶片和茎中的表达量进行了检测（图6）。结果表明：在石牌广藿香叶片生长发育过程中， HGMR、MDD、MK表达下降，但当叶片衰老后，表达则又增高;茎发育过程中，HMGR、MDD、MK表达均呈增高趋势，在老茎中表达最高。在高要广藿香中，发现了相似的基因表达模式;唯有HGMR在叶中表达趋势与石牌广藿香不同，其在成熟叶片中高表达，幼叶次之，老叶最低（图6）。

2.2 广藿香醇和广藿香酮的含量与相关基因表达的关系

为了进一步确定广藿香在药材商品中最佳的药用部位，本研究测定了酮型广藿香在成熟茎、老茎、成熟叶、 老叶四个部位的广藿香醇和广藿香酮的含量。结果表明：石牌广藿香的老茎广藿香酮含量最高，为301 μg·g1，而成熟茎为233 μg·1，二者差异较大;而高要广藿香的老茎和成熟茎中广藿香酮的含量差异不大，老茎为242 μg·g1，成熟茎为239 μg·g1（图7）。石牌广藿香和高要广藿香嫩茎和嫩叶挥发油含量过低，本研究未对其进行测定。同样，广藿香醇在老茎和成熟茎的挥发油太少，也未能检测到其含量。两种酮型广藿香的广藿香醇含量，老叶均比成熟叶高，其中石牌广藿香的老叶广藿香醇的含量为559 μg·g1，成熟叶为403 μg·g1;高要广藿香的老叶广藿香醇的含量为445 μg·g1，成熟叶为415 μg·g1。

为了进一步评价基因与植物化学物质之间的关系，使用XLSTAT将不同部位与采收时期广藿香醇和广藿香酮的含量以及相对应基因的表达水平进行相关性分析，估计Pearson相关系数。结果表明，MK （R2=0.758， P<0.05）和MDD （R2=0.758， P<0.05）的表达加速了广藿香酮的积累。

3讨论与结论

广藿香药材的道地品种属于酮型广藿香如高要广藿香，而石牌广藿香在市场上却因为产量低而少见。qPCR被认为是检测RNA水平最灵敏、高效快捷的方法，常用于单个或多个基因的表达分析。本研究分析结果显示，MVA途径3个基因的表达模式在石牌和高要两个栽培种间高度相似。在遗传学中，基因表达是以环境依赖方式连接基因型和表型的基本因素（Nevozhay et al.， 2012）。这可能从分子水平上解释了高要广藿香和石牌广藿香同属一个化学型的原因，为市场上用高要广藿香代替石牌广藿香提供了理论支持。石牌广藿香在宋代就从印度尼西亚传入，并移植到中国广东省的高要等地区。目前，广藿香的种植主要是靠扦插繁殖和组织培养。因此，酮型广藿香的基因变异和物种分化有限，不利于物种变异（徐颂军等，2003;吴友根等，2007）。这可能是高要广藿香的MVA途径基因表达模式与石牌广藿香相似的原因。C657C382-18B4-494A-8042-F7973D3AA0B0

植物中萜类化合物的产生和积累具有组织特异性特点，它们的增加与发育阶段有关（Yu et al.， 2015）。本研究发现，在石牌广藿香和高要广藿香两个品种叶片的三个发育阶段广藿香酮含量都非常低，而在两个品种的衰老茎中，广藿香酮含量增加。因此，广藿香酮的生物合成也具有组织特异性和生长周期依赖性，在种植酮型广藿香时，茎应受到更多的关注。

从广藿香药材质量优良评价来看，广藿香酮含量是广藿香质量的重要指标。本研究发现MK和MDD基因可能是影响广藿香中广藿香酮含量的重要基因，为通过代谢工程转基因方法提高广藿香中广藿香酮的含量提供了研究思路。此外，二者在广藿香酮生物合成中的作用还需要进一步通过转基因等分子生物学和代谢工程手段验证。

人们普遍认为，道地药材是药用植物长期适应环境的结果，遗传因素可能是道地药材与非道地药材化学成分差异显著的根本原因。本研究结果发现，高要广藿香和石牌广藿香的MK和MDD基因表达模式相似，在石牌广藿香和高要广藿香中，广藿香酮的含量均较高，表明高要广藿香能够代替石牌广藿香具有合理性。MVA途径的MK和MDD基因与广藿香酮合成正相关，本研究结果阐明了广藿香的基因表达和化学成分相关性，将有助于萜类产物生物合成的提高，为更好地利用广藿香奠定了基础。

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（责任编辑周翠鸣）

收稿日期：  2021-03-24

基金項目：  浙江省医药卫生科技计划项目（2019RC270）;宁波市自然科学基金（2019A610372）;广东省科技计划项目（2019B030316019）;广东省自然科学基金（2018A030313255）

第一作者： 康大力（1981-），博士，副主任中药师，研究方向为中药药理与中药生物技术，（Email） dlkang500@163.com。

通信作者：  欧阳蒲月，博士，副教授，研究方向为药用植物生物技术，（Email）ouyangpy@gdyzy.edu.cn。C657C382-18B4-494A-8042-F7973D3AA0B0