活血软膏对膝骨关节炎兔血清中氧自由基的影响*

汪芳 李玉彬 刘婷 回连强 穆兰澄 谢利民 沈鸿※

（1.中国中医科学院中药研究所，北京 100700；2.中国中医科学院广安门医院，北京 100053）

活血软膏是由羌活、独活、乳香、没药等中药组成的复方制剂，具有温经散寒祛湿、活血消肿止痛功效。主治膝骨关节炎引起的疼痛、肿胀、关节活动不利等。膝骨关节炎（Knee osteoarthritis，KOA）是以膝关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病[1]，其发病可能与遗传、性别、年龄增长、体质量增加及创伤、炎症等多种因素有关[2]。通过兔膝关节损伤所致骨关节炎的动物模型，观察活血软膏对膝骨关节炎兔血清中氧自由基（SOD、MDA、LPO）的水平变化，从兔血清中的氧自由基代谢和关节软骨退变角度，研究活血软膏对软骨组织损伤的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 受试样品活血软膏，由中国中医科学院广安门医院大兴制剂中心提供，批号：20171126。

1.2 实验动物日本大耳白兔，体质量2.5～2.7 kg，购自北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司，许可证编号为SYXK（京）2016-0013。动物给药剂量，是根据人与动物体表面积折算的等效剂量，经皮给药。

1.3 试剂与仪器扶他林软膏（北京诺华制药有限公司，批号：vp0678 201909）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA），过氧化脂质（LPO）酶联免疫测定（ELISA）试剂盒（Shanghai FANKEL Industrial Co.，Ltd.品 牌Fankew，批号分别为LOT.NO.20090145R，LOT.NO.20090121R，LOT.NO.20090117R）；电子计价秤（大阳衡器有限公司产品）；酶标分析仪（Rayto RT-6100，美国雷社公司生产）。

1.4 实验方法参考Hulth 等方法[3,4]稍加改进，复制兔KOA 模型。取大耳白兔60 只，体质量2.5～2.7 kg，雌雄各半，随机选取兔10 只，设为正常组，余下兔进行造模，在兔右后腿膝关节的股骨内髁关节面造成关节软骨损伤并剪断前交叉韧带后，逐层缝合切口，纱布包裹伤口。正常组则切开皮肤后立即缝合。术后2 周，将兔随机分为模型组；阳性扶他林组（1 cm/kg）；活血软膏高、中、低剂量组（6 g、3 g、1.5 g 生药/kg）。经皮给药，连续6 周。给药结束当日晚上，兔禁食禁水12 h。次日早上，兔称重，耳静脉取血后，空气栓塞处死动物，用酶联免疫（ELISA）法检测各组兔血清中氧自由基SOD、MDA、LPO 的含量，并肉眼观察手术后兔步态运动情况。

1.5 兔步态评价分别于造模前、造模给药2、4、6 周时进行观察，做步态评价，步态分级按Coderre 的方法，即0 级：正常行走；I 级：轻微跛行，受试下肢略有弯曲；Ⅱ级：中度跛行，受试下肢刚触及地面；Ⅲ级：重度跛行，受试下肢略离开地面，后足着地行走[5]。

1.6 大体形态观察及评价肉眼观察关节软骨色泽，光滑程度，有无糜烂及溃疡，有无骨赘形成；关节液的颜色及黏稠度，滑膜有无增生等。评分标准：0分：关节面光整，色泽如常；1分：关节面粗糙，有裂隙且色泽灰暗；2分：关节面糜烂，软骨有缺损；3分：关节面溃疡，缺损严重；4分：软骨剥脱，软骨下骨质暴露[6]。

1.7 统计学方法采用SPSS 20.0 进行数据统计，数据用（）表示，比较采用单因子方差法进行处理，组间两两比较，方差齐时用LSD 方法分析，方差不齐时用Dunnetts 方法分析；等级资料采用秩和检验，以P＜0.05和P＜0.01 代表差异具有统计学意义和显著统计学意义。

2 结果

2.1 兔步态评价正常组兔正常活动，无关节肿胀；在造模给药2 周后，模型组兔大部分兔神态萎靡，行走受阻严重，关节明显肿胀，扶他林组和活血软膏组，部分兔神态萎靡，行走受阻，关节出现肿胀。给药4～6 周治疗后，模型组兔神态有轻度萎靡，行走受阻有所改善，关节肿胀有所改善。扶他林组和活血软膏组，家兔神态基本正常，行走受阻明显改善，除部分动物关节有肿胀外，其他基本恢复。与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 活血软膏各组家兔实验前后步态变化情况

2.2 关节软骨大体形态学观察正常组兔关节软骨外观呈极淡蓝色，光泽有弹性，关节面光滑，关节边缘齐整，无骨赘形成。关节液量较少，质地清澈透明。滑膜未见增生肥厚。模型组外观呈暗黄色，无光泽，不透明，软骨变薄，表面粗糙糜烂，部分有溃疡形成，多数动物关节可见不同程度的骨赘形成，关节液量增多，呈泡沫状、浑浊，软骨有明显缺损，关节滑膜增生肥厚明显。扶他林组和活血软膏组，兔关节软骨外观呈淡黄色，失去原有光泽，半透明，软骨变薄，部分关节表面粗糙不平，糜烂，有不同程度的骨赘形成，关节液轻微黏稠浑浊，量较模型组少，软骨未见明显缺损。滑膜有轻度增生。与模型组相比，差异具有统计学意我（P＜0.05）。见表2、图1。

图1 各组兔滕关节软骨大体形态学观察

表2 活血软膏各组兔膝关节软骨大体形态观察

2.3 对血清中氧自由基的影响活血软膏所试组，均能降低兔血清中MDA 和LPO 的含量，提高SOD 活性。高、中剂量组与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 活血软膏对兔KOA 血清中氧自由基的影响（）

表3 活血软膏对兔KOA 血清中氧自由基的影响（）

注：与模型组比较，*P＜0.01。

3 讨论

中医学认为KOA 的发生与“虚、邪、瘀”密切相关，归属“膝痹”“骨痹”等范畴，是一种因外邪侵扰筋骨关节，闭阻经脉气血而导致肢体沉重、关节疼痛的疾病，病机为肝肾亏虚、筋失濡养、血瘀阻络[7]。中医对痹证的治则是补肝益肾、散寒除湿、活血通络止痛。刘洪旺等[8]用六味地黄丸加减治疗肾虚型骨关节炎，取得满意疗效。周遵谦等[9]重用活血化瘀之品，治疗KOA 效果明显。黄柏强[10]用中医补肾活血治疗KOA，通过改善局部微循环，使软骨细胞的基因转录活跃，增强胶原和蛋白聚糖合成功能，而抑制关节软骨细胞凋亡。现代研究表明，KOA 发生、发展与氧自由基代谢有一定关系，自由基是带有不成对电子的具有高度反应活性的基团，包括由氧派生的自由基和体内各类物质，例如药物、毒物等，通过体内代谢而产生的多种自由基，在机体正常情况下，可将体内代谢所产生的自由基及时清除。但在病理情况下，机体对自由基清除率下降，会导致自由基堆积，引发疾病的产生。实验研究表明该类自由基是引起关节软骨变质及关节滑液改变的重要原因[11]。MDA 和LPO 都是氧自由基作用后过氧化反应的产物，在KOA 患者中，氧自由基作用于软骨细胞，可以引起细胞膜的脂质过氧化，MDA 和LPO 的产生增多，检测血清中LPO 和MDA 的含量，可反映脂质过氧化反应的程度。SOD 是一种活性蛋白酶，是保护氧化损伤细胞的一种关键酶，它通过清除软骨损伤所产生的氧自由基，缓解关节软骨被破坏，起到保护关节软骨作用[12,13]，从而抑制机体过氧化反应，使细胞免受氧自由基的损伤，SOD 可以参与机体抗感染、免疫及炎症反应[14]。通过测定血清中SOD的含量变化，可反映机体对氧自由基的清除能力[15]。因此，测定KAO 兔血清中MDA、SOD 和LPO 含量变化，可以研究机体软骨细胞的受损程度，以及治疗手段对KOA 是否有效。孙材江等[16]检测了骨关节炎患者机体内自由基水平，发现该类患者红细胞内SOD 含量明显降低，血浆中LPO 含量明显增高，表明氧自由基影响了软骨细胞胶原合成，造成了脂质过氧化，使软骨细胞胶原合成场受到了损害。Shingu等[17]研究发现，氧自由基参与了软骨基质降解，软骨细胞胶原酶的激活受到影响，抑制了软骨基质的降解。实验结果显示，模型组中兔血清中MDA 和LPO 含量明显高于正常组，SOD 含量明显低于正常组，说明氧自由基参与了KOA 的发病，经活血软膏治疗后，MDA 和LPO 含量明显下降，SOD 含量明显升高，说明活血软膏具有清除氧自由基作用，对软骨组织损伤有治疗作用，并能明显改善KOA 兔的行走状态，对膝关节软骨的损伤，亦有明显的修复作用。其作用机制有待进一步研究。