反相高效液相色谱法同时测定人膀胱癌T24细胞中三磷酸腺苷及其代谢物的含量

朱会宇

(河南中医药大学 药学院,郑州 450000)

所有生物过程都伴随着能量代谢,细胞内的能量供应主要依赖于线粒体合成的三磷酸腺苷(ATP)[1-2]。因此,建立有效的细胞内ATP及其代谢产物[二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)]的定量方法是非常有必要的。ATP、ADP 和AMP的结构和理化性质非常相似,同时测定会有一定困难。目前,相关分析方法主要有荧光法[3]、电化学法[4]、生物传感器[5]、电化学生物传感器[6-7]、高效液相色谱法[8-10]、化学发光法[11-13]以及核磁共振波谱法[14],但这些方法不能同时测定ATP及其代谢物,且分析时间长、系统不稳定、细胞内小分子杂质干扰大。鉴于此,本工作开发了一种稳定、可靠且可同时测定细胞内ATP 及其代谢物含量的方法,并取得了满意结果。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

岛津LC-20A 型高效液相色谱系统;Pall OD003C34型超滤管;Gibico含谷氨酸RPMI-1640培养基;血球细胞计数板;Thermo Fisher Sorvall Micro 17&21型离心机。

单标准储备溶液:10 mmol·L－1,取适量ATP、ADP、AMP标准品,用水溶解和稀释,摇匀备用。

混合标准溶液系列:取适量上述单标准储备溶液,用水逐级稀释,配制成0.1,0.5,2,4,10,20,40,80,100μmol·L－1混合标准溶液系列。

磷酸盐缓冲溶液:pH 7.2～7.4。

ATP、ADP、AMP标准品的纯度分别为99%,98%,99%。磷酸氢二钠、甲醇为色谱纯;其他所用试剂均为分析纯;试验用水为超纯水,使用前过0.22μm 滤膜。

1.2 色谱条件

Angela Venusil MP C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)。流动相为体积比为96∶4 的含50 mmol·L－1磷酸氢二钠和15 mmol·L－1三乙胺的水溶液(用乙酸调节酸度至pH 7.88)、甲醇的混合溶液;等度洗脱;流量0.8 mL·min－1;进样量20μL;检测波长254 nm。

1.3 试验方法

在培养基中加入人膀胱癌T24 细胞1 mL、100 g·L－1链霉素溶液5.5 mL、胎 牛血清溶 液55 mL、100 U·m L－1青霉素溶液5.5 mL,在5%(体积分数)二氧化碳(底气为氧气)环境中于37 ℃培养2 d,用血球细胞计数板统计细胞数。用冷磷酸盐缓冲液(pH 7.2～7.4)清洗两次,在其中加入80%(体积分数)冷甲醇溶液500μL,在冰上放置5 min,用于裂解细胞,释放3 种目标物。以12 000 r·min－1转速离心10 min,上清液置于超滤装置中,于4 ℃以13 500 r·min－1转速离心15 min。分 取240μL滤液,加入50 mmol·L－1磷酸氢二钠和15 mmol·L－1三乙胺的混合溶液(用乙酸调节酸度至pH 7.88)240μL,所得样品溶液供高效液相色谱仪分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按照试验方法分析样品溶液和10μmol·L－1混合标准溶液,结果见图1。

图1 样品溶液和混合标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of sample solution and mixed standard solution

结果显示:3种目标物色谱峰峰形及分离效果(分离度为1.5和1.3)均较好,ATP、ADP、AMP的保留时间分别为15.55,16.81,14.03 min;样品溶液中杂质几乎在AMP前出峰,对3种目标物干扰较小。

2.2 色谱条件的选择

试验考察了流动相中的磷酸盐分别为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠,胺类物质分别为二乙胺、三甲胺、三乙胺时对3种目标物测定的影响。结果显示,当磷酸盐选用磷酸氢二钠,胺类物质选用三乙胺时,分离度大于1.5,测定值的相对标准偏差(RSD,n＝7)不大于5.0%,满足分析要求。因此,试验选择磷酸氢二钠和三乙胺配制流动相。

试验还考察了流动相中甲醇体积分数分别为2%,4%,6%时对3种目标物测定的影响。结果显示:当甲醇体积分数为2%时,ATP 和AMP不能有效分离;当甲醇体积分数为6%时,3种目标物均不能有效分离;甲醇体积分数为4%时,3种目标物的分离效果均较好,因此试验选择以此体积分数配制流动相。

试验用乙酸调节水相的酸度,并考察了酸度分别为pH 6.08,7.03,7.88时对测定的影响。结果显示:当酸度为pH 7.03时,3种目标物均不能有效地分离;当酸度为pH 6.08 时,AMP和ATP的分离度(0.9)较差;当酸度为pH 7.88时,3种目标物峰形以及分离效果较好。因此,试验选择将水相的酸度调节至pH 7.88。

试验进一步考察了流量分别为0.6,0.8,1.0 mL·min－1时对3种目标物测定的影响。结果显示:当流量为0.6 mL·min－1时,3种目标物分离效果较好,但分析时间过长;当流量为1.0 mL·min－1时,3 种目标物均不能有效分离;当流量为0.8 mL·min－1时,分离度和分析时间均满足要求。因此,试验选择以0.8 mL·min－1流量进行后续分析。在优化的色谱条件下,分析时间可缩短至30 min内。

2.3 标准曲线和检出限

按照仪器工作条件分析混合标准溶液系列,以3种目标物的浓度为横坐标,以其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线,所得标准曲线的线性范围均为0.1～100μmol·L－1,其他线性参数见表1。

表1 线性参数Tab.1 Linearity parameters

分别以不小于3倍信噪比对应的浓度作为检出限,所得检出限均为0.005μmol·L－1。

2.4 精密度和回收试验

按照色谱条件重复测定10μmol·L－1混合标准溶液5 次,计算测定值的RSD,ATP、ADP 和AMP所得结果分别为4.4%,2.6%,3.8%,表明仪器精密度较好。

按照试验方法对实际样品进行3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定5次,计算回收率和测定值的RSD,所得结果见表2。

表2 精密度和回收试验结果(n=5)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n=5)

由表2可知,3种目标物的回收率为82.2%～87.7%,测定值的RSD 为2.0%～4.9%。

2.5 样品分析

按照试验方法分析实际样品,所得细胞数为2×107,ATP、ADP 和AMP的检出量分别4.593,0.508,0.147 nmol。

2.6 孵育温度对细胞中ATP、ADP和AMP含量的影响

人膀胱癌T24 细胞在培养24 h 后,又分别在4,37 ℃下孵育2.5 h,按照试验方法测定4,37 ℃下细胞样品(记为T-4和T-37)中ATP、ADP和AMP含量,血球细胞计数板统计细胞数为106,3种目标物含量见图2。

图2 孵育温度对细胞中ATP、ADP和AMP含量的影响Fig.2 Effect of incubation temperature on the contents of ATP,ADP and AMP in cells

由图2可知,ATP、ADP和AMP含量受温度调节,孵育温度与细胞内ATP 含量呈负相关,与ADP与AMP呈正相关,这与文献[15]的研究结果一致,进一步说明本方法可靠。

本工作以反相高效液相色谱法测定人膀胱癌T24细胞中ATP、ADP 和AMP 的含量,该方法稳定性好、线性范围宽、检出限低、检测快速、样品量少、操作简单,可为细胞内能量代谢物的研究提供参考。