非小细胞肺癌组织中miR-30a和CD73的表达水平与预后相关性分析

马彦娥，苏虎艳，王倩如，郝光军（榆林市第一医院肿瘤诊疗中心，陕西榆林 719000）

肺癌是美国人癌症相关死亡的主要原因，每年约有15.4万美国人死于肺癌[1]。近年来，肺癌在中国的发病率和死亡率也逐年增加，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是一种常见的肺癌类型，约占肺癌总数的80%，10年总生存率仍较低，寻找能早期评估NSCLC患者预后的指标非常关键[2]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）在肿瘤中的研究越来越受到关注，miRNA通过与靶基因mRNA特异性结合来调控mRNA蛋白表达，参与肿瘤发生发展进程[3]。最新研究发现[4]，微小RNA-30a（miR-30a）在NSCLC患者血清和肿瘤组织中均表达下调，低表达miR-30a与较差生存率有关，具有作为NSCLC筛查和预后生物标志物的潜力。CD73，也称为胞外5’-核苷酸酶（ecto-5’-nucleotidase），有研究发现，CD73的过表达在NSCLC肿瘤中产生了免疫抑制性微环境，可催化释放细胞外腺苷抑制T细胞的抗肿瘤功能并诱导T细胞凋亡，从而帮助肿瘤细胞逃避免疫监视[5-6]。因此，本研究通过同时检测NSCLC肿瘤组织中miR-30a和CD73表达情况，分析其表达水平与患者预后的关系，讨论其临床意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2015年8月～2019年12月于陕西省榆林市第一医院术后病理检查证实为非小细胞肺癌组织120例为研究组，其中男性67例，女性53例，年龄34～76岁，中位年龄64岁。病理类型：腺癌76例，鳞癌44例；分化程度：低分化癌47例，中高分化癌73例；TNM分期：Ⅰ期34例，Ⅱ期61例，Ⅲ期25例；发生淋巴结转移54例，未发生淋巴结转移66例。50例正常癌旁组织（距离癌组织5cm以上，其中有70例患者癌旁组织资料缺失）为对照组。纳入标准：①均为首次确诊，并于本院治疗；②预计生存时间＞3个月；③术前未接受过其他任何抗肿瘤治疗；④TNM分期为Ⅰ～Ⅲ期；⑤临床资料及随访资料完整。排除标准：①并发其他恶性肿瘤；②有肺癌家族史；③并发精神、意识、听觉障碍患者；④并发其他肺部疾病。本研究获得本院伦理委员会批准通过。

1.2 仪器与试剂 实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）仪（济南来宝医疗器械有限公司），TRIzol试剂（美国Sigma公司），反转录试剂盒和qRT-PCR扩增试剂盒（Thermo Scientific公司），兔抗人CD73多克隆抗体（艾美捷科技有限公司），DAB显色试剂盒（上海博湖生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR技术检测miR-30a相对表达量：首先将组织样本匀浆，利用TRIzol试剂提取组织中的RNA，并检测RNA的浓度和纯度。按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，并进行PCR扩增。miR-30a以U6为内参，引物序列由上海生工生物工程公司合成。miR-30a上游引物：5’-ACAC TCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC-3’，下 游引物：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AA CGCTTCACGAATTTGCGT-3’。利用2-ΔΔCt计算miR-30a相对表达量。

1.3.2 免疫组织化学法检测CD73的表达情况：将组织样本用甲醛固定后常规石蜡包埋，以4μm连续切片，再常规脱蜡、水化、抗原修复，采用链霉亲合素-生物素复合物（SP）法进行染色，方法步骤严格按试剂盒说明书操作，一抗采用兔抗人CD73多克隆抗体，稀释浓度1∶100，滴加一抗后于4℃冰箱孵育过夜，再滴加生物素标记的二抗，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、中性树胶封片，显微镜下观察。用磷酸盐缓冲液（PBS）作为阴性对照。

以组织细胞显色为棕黄色为表达阳性，选取5个高倍镜视野进行双盲法评定，由病理科两位经验丰富的医师分别给出结果。按染色强度评分：无染色0分，浅黄色1分，黄色或黄棕色2分，棕褐色3分；按阳性细胞百分比评分：无阳性细胞记0分，＜25%记1分，26%～50%记2分，51%～75%记3分，＞75%记4分。取两种方法得分的乘积，＞1分为表达阳性（+），≤1分为表达阴性（-），≥3分为高表达，＜3分为低表达。

1.4 统计学分析 采用SPSS25.0软件进行数据的录入与分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用独立样本t检验比较NSCLC癌组织和正常癌旁组织中miR-30a的表达水平；计数资料以频数（n）或百分比（%）表示，采用χ2检验分析miR-30a和CD73表达水平与NSCLC患者临床病理参数之间的关系；采用Kaplan-Meier法进行生存分析，组间差异比较利用对数秩检验（LogRank test）；多因素COX回归分析影响NSCLC患者预后的危险因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-30a在NSCLC癌组织和正常癌旁组织中的表达水平比较 miR-30a在NSCLC癌组织中的表达水平为1.17±0.21，明显低于正常癌旁组织（1.62±0.48），差异有统计学意义（t=8.521，P=0.000）。

2.2 免疫组织化学检测结果 见图1。CD73在NSCLC癌组织中主要定位于细胞质和细胞膜，高表达标本染色以棕色为主。CD73在NSCLC癌组织及癌旁正常组织中的阳性表达率分别为63.33%（76/120）和32.00%（16/50），差异有统计学意义（χ2=13.955，P=0.000）。

图1 免疫组织化学检测CD73在NSCLC癌组织和正常癌旁组织中的表达（SP，×200）

2.3 NSCLC癌组织中miR-30a，CD73表达情况与患者临床病理参数之间的关系 见表1。以miR-30a在癌组织中表达水平中位数（1.20）为分界点将其分为miR-30a高表达组（61例）和低表达组（59例），根据免疫组织化学评分是否≥3分将其分为CD73高表达组（68例）和低表达组（52例），分析可知，miR-30a，CD73表达与NSCLC患者年龄、性别、病理类型无关（均P＞0.05），与肿瘤分化程度、临床分期、淋巴结转移有关（均P＜0.05）。

表1 NSCLC癌组织中miR-30a，CD73表达情况与患者临床病理参数之间的关系

2.4 生存分析 见图2。随访一年，统计NSCLC患者miR-30a，CD73表达情况与生存状况的关系，结果显示miR-30a高表达组NSCLC患者一年累积生存率（86.89%, 53/61）明显高于低表达组（59.32%,35/59）（Log Rankχ2=11.652，P=0.000）；CD73高表达组NSCLC患者一年累积生存率（58.82%,40/68）明显低于低表达组（92.31%, 48/52）（Log Rankχ2=16.894，P=0.000）。

图2 miR-30a，CD73表达与NSCLC患者生存时间的关系

2.5 影响NSCLC患者预后的危险因素分析 见表2。以NSCLC患者预后不良（随访时患者死亡）为因变量（1=预后不良，0=预后良好），将TNM分期、分化程度、淋巴结是否转移及miR-30a，CD73纳入自变量进行多因素COX回归分析，结果显示分化程度低（HR=1.677，95%CI：1.092～2.576），发生淋巴结转移（HR=1.574，95%CI：1.043～2.376）是影响NSCLC患者预后不良的危险因素，而miR-30a低表达（HR=1.479，95%CI：1.027～2.130），CD73高表达（HR=1.501，95%CI：1.059～2.128）是影响NSCLC患者预后不良的独立危险因素。

表2 影响NSCLC患者预后的危险因素

3 讨论

肺癌是全球范围内发病率较高的恶性肿瘤之一，严重影响患者的身心健康。NSCLC作为肺癌中的一种，主要源于支气管黏膜上皮或肺泡上皮细胞恶化，根据其病理类型主要有腺癌、鳞癌、大细胞癌、腺鳞癌等[7]。NSCLC的发病机制尚不清楚，但根据流行病学研究显示，主要与环境因素、自身因素及遗传因素等有关。因此，需要找到能早期评估NSCLC患者预后的生物学指标为改善预后提供依据。

miRNAs是一类小的（平均22个氨基酸）内源性非编码RNA分子，在癌症的发生及进展中起重要作用，主要是通过与位于目标靶基因mRNA的3’非翻译区的目标序列结合来调节致癌和/或肿瘤抑制基因，最终导致目标mRNA降解或蛋白翻译受阻[8-9]。研究发现，miR-30a在肿瘤转移中被下调，对维持上皮性状至关重要，因此miR-30a是转移性癌症中高度下调的miRNAs之一，在转化生长因子β促进的肿瘤转移过程中下降，最终导致侵袭、转移相关间充质因子表达增加[10-11]。YU等[12]研究报道，胃癌组织中miR-30a表达水平较癌旁非恶性组织低，其可通过靶向成纤维细胞活化蛋白α抑制胃癌转移。此外有研究表明[13]，特发性肺间质性纤维化患者支气管肺泡灌洗液中miR-30a表达下调，其可通过靶向成纤维细胞活化蛋白α减弱转化生长因子β1诱导的肺成纤维细胞活化。本研究结果显示，在NSCLC患者肿瘤组织中miR-30a相对表达量明显低于癌旁正常组织，与上述结论一致。分析其水平与患者临床病理参数的关系，结果表明肿瘤分化程度低、临床分期Ⅲ期、发生淋巴结转移患者的miR-30a水平明显较低，提示miR-30a水平可能与NSCLC肿瘤分化、迁移有关。ZHOU等[14]研究发现，胰腺导管腺癌组织中miR-30a-5p表达降低与患者预后不良有一定关系，且上调miR-30a-5p表达可增加胰腺导管腺癌对吉西他滨的化疗敏感性。此外，有研究证实[15]，miR-30a可削弱NSCLC肿瘤细胞对新辅助化疗（即DDP和PEM联合治疗）的抗性，抑制DDP/PEM诱导的自噬并促进DDP/PEM引发的NSCLC肿瘤细胞凋亡，因此低水平的miR-30a与NSCLC患者淋巴结转移、晚期TNM分期及较差生存期有关，为临床治疗NSCLC提供潜在治疗靶标。本研究分析了NSCLC患者术后一年的生存情况，结果显示miR-30a低表达者具有较差生存情况，进一步COX回归分析结果显示低miR-30a是影响NSCLC患者预后不良的独立危险因素，miR-30a的表达可能作为预测NSCLC预后的有效指标。

研究发现，CD73主要在内皮细胞、上皮细胞及一些免疫亚群细胞上内源性表达，可催化细胞外单磷酸腺苷去磷酸化为腺苷和无机磷酸盐[16]。CD73的表达与上皮-间质转化和免疫耐受的肿瘤微环境转录组特征密切相关，临床证实这些与疾病进展和治疗耐药性有关[17]。DIETRICH等[18]研究表明，抑制CD73表达有助于增强T24人膀胱癌细胞系的放射敏感度。沈海涛等[19]研究发现，外周血CD73+表达水平升高与原发性肝癌发生及患者肝损伤密切相关。国内学者高锋等[20]研究发现，CD73在NSCLC肿瘤组织中表达水平较正常肺组织明显升高，且与TNM分期、淋巴结转移有关，与本研究结果一致，提示CD73参与NSCLC肿瘤细胞浸润、转移。该研究还发现过表达的CD73可促进T细胞凋亡并抑制T细胞抗肿瘤作用，证实CD73是一种致癌因子。另有研究发现，在正常支气管和肺泡上皮不表达CD73，而在癌细胞、癌症相关成纤维细胞和肿瘤浸润淋巴细胞中过度表达，且CD73的高表达与乳酸脱氢酶5和癌细胞的缺氧诱导因子1α表达直接相关[6]。本研究结果显示，CD73高表达NSCLC患者一年累积生存率明显低于低表达患者，且高表达CD73是影响NSCLC患者预后不良的独立危险因素，表明CD73在NSCLC预后预测中起重要作用。早期研究发现[21]，CD73是miR-30a-5p的直接靶标，而过表达miR-30a-5p抑制了NSCLC体外和体内的细胞增殖，CD73与miR-30a是否存在直接靶向关系有待进一步细胞实验验证。

综上所述，NSCLC的发生发展受多因素共同调控，miR-30a表达下调，CD73表达上调，二者表达水平与肿瘤分期、分化程度及淋巴结转移有关，是影响NSCLC患者预后不良的独立危险因素。CD73，miR-30a在NSCLC中的具体作用机制有待进一步体外实验证实。