AML不同疾病阶段患者T细胞耗竭及相关细胞因子表达水平实验研究

萧杏贤，刘 德，姜朝晖（江门市中心医院血液内科，广东江门 529000）

骨髓微环境中存在着促进肿瘤生长而抑制肿瘤免疫应答的T细胞亚群，包括调节性T细胞（T cell regulatory, Tre）和耗竭性T细胞（T cell exhaustion, Tex）。T细胞耗竭主要是T细胞逐渐丧失功能，表现为高表达免疫位点[程序性细胞死亡1（PD1）、黏液蛋白域3（TIM-3）、淋巴细胞激活基因3（LAG-3）等]对抗原的免疫应答能力下降，可导致T细胞迁移、增殖、趋化和细胞杀伤能力下降[1-6]。研究表明，在肿瘤免疫应答过程中，抗原特异性T细胞逐渐出现耗竭状态，分化为Tex，削弱对肿瘤的免疫监视、应答及杀伤作用，促进肿瘤的发生发展[1,6]。目前关于急性髓系白血病患者（acute myeloid leukemia，AML）中Tex水平及预后研究较少，尤其是AML患者不同疾病阶段下Tex的水平变化，而探讨AML免疫位点的Tex表达水平有助于了解肿瘤的免疫逃逸机制和寻找精准的免疫治疗靶点。本研究拟探讨AML不同疾病阶段患者的Tex水平及预后分析，有助于预测白血病患者的治疗疗效及预后，为寻求免疫治疗靶点提供重要的临床证据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2017年2月～2020年6月接受治疗的AML患者120例，其中男性68例，女性52例，平均年龄32.6±9.4岁；包括急性粒细胞白血病微分化型患者3例，急性粒细胞白血病未分化型患者18例，急性粒细胞白血病部分分化型患者54例，急性早幼粒细胞白血病患者2例，急性粒单核细胞白血病患者20例，急性单核细胞白血病患者23例。AML诊断符合2016年WHO髓系肿瘤和急性白血病诊断标准。根据疾病不同阶段及治疗效果分为初诊组45例（ND组）、完全缓解组35例（CR组）、未缓解组24例（NR组）和复发组16例（HR组）。选择同期60例体检健康者为健康对照组（HC组），男性39例，女性21例，平均年龄31.5±8.5岁。AML组与对照组在年龄、性别等一般临床资料上差异无统计学意义（P＞0.05）。

纳入标准：年龄≥18岁，经血细胞计数及骨髓涂片确诊为AML患者，1月前未接受相关治疗的患者。

排除标准：并发严重感染、脏器功能不全或并发其他血液性疾病者；近6个月内接受放化疗和免疫抑制剂治疗者。本项研究通过我院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 BD Accuri C6 Plus型流式细胞 仪（美 国BD公 司），PD-1+，TIM-3+,IL-2+，IFR-γ+，CD4+T,CD8+T抗体（美国BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 耗竭性T细胞流式细胞检测：收集研究对象的外周血，骨髓穿刺抽取骨髓5～10 ml。分离外周血单个核细胞，加入含有10ml/dl胎牛血清的RPMI-1640培养液中培养。取106个细胞，加入1ml/dl多聚甲醛固定细胞后，离心去上清加入流式缓冲液，置于5 ml流式管中，分别加入PD-1+，TIM-3+,IL-2+，IFR-γ+，CD4+T,CD8+T抗体（购自美国BD公司）孵育30 min，漂洗后于室温避光下孵育30 min，流式缓冲液漂洗3次，400 g离心5 min，弃上清加入流式缓冲液200μl，在BD Accuri C6 Plus型流式细胞仪进行检测，记录各Tex细胞的绝对计数和百分比。

1.3.2 分组标准：根据AML患者疗效评判标准[5]：初诊患者（ND）：初次接受治疗的AML患者；完全缓解（CR）：骨髓液显示原粒细胞≤5%，巨核细胞及红细胞数量正常。外周血分类无白血病细胞，血细胞计数血红蛋白(Hb)＞100 g/L,中性粒细胞＞1.5×109/L,血小板计数＞100×109/L；无白血病细胞浸润的临床症状及体征；未缓解（NR）：AML患者接受治疗后骨髓象和外周血象指标及临床症状未见改善；血液学复发（HR）：在患者完全获得缓解后外周血中又出现白血病细胞或髓系原始细胞＞5%。

1.3.3 观察指标：比较AML患者不同疾病阶段（ND，CR，NR，HR）和HC者的外周血和骨髓中不同免疫检查点Tex表达水平（PD1+TIM-3+T，PD1+T和TIM-3+T）及IL-2和IFN-γ细胞因子分泌情况。

1.4 统计学分析 采用SPSS21.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示(±s)，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用Bonferroni法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组间PD1+TIM-3+T细胞水平 见表1。流式细胞术结果显示，AML不同疾病阶段患者外周血和骨髓中CD4+PD1+TIM-3+T和CD8+PD1+TIM-3+T水平高于HC组（F=9.149, 6.068, 3.438, 4.807, 均P＜0.001）。CR患者外周血和骨髓中CD4+PD1+TIM-3+T细 胞（t=6.320, 8.841, 37.420; 18.221, 8.216,30.176, 均P＜0.001）和CD8+PD1+TIM-3+T细胞(t=5.417, 6.096, 12.610; 5.201, 6.034, 10.874, 均P＜0.001)水平明显低于ND，NR和HR患者，差异均有统计学意义。AML患者外周血和骨髓中CD8+PD1+TIM-3+T细胞数明显高于CD4+PD1+TIM-3+T细胞数（t=8.227, 7.289, 均P＜0.001），且ND患者骨髓中CD4+PD1+TIM-3+T和CD8+PD1+TIM-3+T细胞水平明显高于外周血（t=6.297，7.527，均P＜0.001），差异均有统计学意义。

表1 各组间PDI+TIM-3+T细胞水平比较[(±s)%]

表1 各组间PDI+TIM-3+T细胞水平比较[(±s)%]

项目 n 外周血 骨髓CD4+PDI+TIM-3+T CD8+PDI+TIM-3+T CD4+PDI+TIM-3+T CD8+PDI+TIM-3+T ND 45 2.24±0.43 4.35±1.24 5.38±1.62 8.89±1.86 CR 35 1.45±0.52 3.22±0.70 2.25±1.12 6.64±2.28 NR 24 2.75±0.85 5.21±1.08 5.94±2.19 9.03±2.91 HR 16 7.74±1.06 8.95±1.41 10.39±2.03 12.62±3.74 HC 60 0.48±0.21 0.87±0.35 0.71±0.27 1.15±0.54

2.2 各组间PD1+T细胞水平 见表2。ND患者外周血和骨髓CD4+PD1+T和CD8+PD1+T细胞水平明显高于HC组（F=13.810, 8.02, 7.541, 10.540, 均P＜0.001）。CR患者外周血和骨髓中CD4+PD1+T细胞（t=4.576, 3.164, 5.625; 5.012, 4.012, 4.783, 均P＜0.001）和CD8+PD1+T细胞（t=5.293，3.091，5.091;6.012, 2.897, 4.907, 均P＜0.001）明显低于ND, NR和HR患者，差异均有统计学意义。

表2 各组间PDI+T细胞水平比较[(±s)%]

表2 各组间PDI+T细胞水平比较[(±s)%]

项目 n 外周血 骨髓CD4+PDI+TIM-3+T CD8+PDI+TIM-3+T CD4+PDI+T CD4+PDI+TIM-3+T ND 45 33.79±9.52 40.19±8.75 42.49±7.54 46.26±12.25 CR 35 27.99±6.83 31.51±8.24 32.64±7.89 35.24±7.91 NR 24 34.07±6.76 35.24±10.37 39.08±7.84 41.48±12.22 HR 16 38.51±3.85 39.67±5.89 44.54±7.60 47.47±10.55 HC 60 0.48±0.25 6.23±2.38 6.18±2.44 8.11±2.57

2.3 各组间PD1+T细胞产生IL-2和IFN-γ的表达差异 见表3。AML不同疾病阶段患者的外周血和骨髓中CD4+PD1+T细胞和CD8+PD1+T细胞产生的IL-2和IFN-γ细胞因子比较，HR患者外周血和骨髓产生IL-2和IFN-γ细胞因子表达水平明显低于HC组和ND组（F=6.218, 5.925,均P＜0.001），差异有统计学意义。

表3 各组间PD1+T细胞IL-2和IFN-γ的表达[（±s）%]

表3 各组间PD1+T细胞IL-2和IFN-γ的表达[（±s）%]

注：ND vs HR, FND=6.157, 5.868, 4.563, 4.182, 3.979, 5.167, 3.179, 7.192,均P＜0.01; HC vs HR, FHC=7.271, 6.162, 5.178, 4.781, 5.267, 4.892,8.278, 均P＜0.01。

组别 n 外周血IL-2 外周血IFN-γ 骨髓IL-2 骨髓IFN-γ CD4+PD1+T CD8+PD1+T CD4+PD1+T CD8+PD1+T CD4+PD1+T CD8+PD1+T CD4+PD1+T CD8+PD1+T ND 45 27.54±8.54 13.78±4.78 19.58±6.71 28.45±8.95 27.94±10.15 12.56±4.05 22.45±9.45 50.15±14.84 CR 35 27.01±12.12 11.56±6.12 14.45±6.78 27.02±11.65 26.12±11.48 11.26±4.95 20.56±8.54 42.45±12.51 NR 24 25.46±11.45 9.74±4.56 12.54±8.45 26.45±11.41 25.45±11.40 10.26±5.12 20.12±11.36 40.46±17.56 HR 16 19.12±10.21 10.05±5.15 14.10±7.45 24.97±10.45 24.87±12.56 8.72±4.89 19.58±10.47 40.12±16.54 HC 60 28.12±9.87 14.58±6.12 20.45±8.12 29.12±9.02 28.01±9.18 13.01±6.12 23.12±8.49 55.45±16.87

2.4 各组间TIM-3+T细胞水平 见表4。AML患者外周血和骨髓中CD4+TIM-3+T和CD8+TIM-3+T细胞水平明显高于HC组（F=24.230, 9.101, 16.010,12.540, 均P＜0.001），且CR患者中CD4+TIM-3+T和CD8+TIM-3+T细胞水平明显低于HR组(t=3.986,4.621,均P＜0.001)，差异均有统计学意义。

表4 各组间TIM-3+T细胞水平比较[(±s)%]

表4 各组间TIM-3+T细胞水平比较[(±s)%]

项目 n外周血 骨髓CD4+TIM-3+T CD8+TIM-3+T CD4+TIM-3+T CD8+TIM-3+T ND 45 28.34±9.14 28.83±8.48 35.75±7.30 38.76±16.55 CR 35 23.08±9.20 24.27±5.78 32.63±11.85 36.16±13.19 NR 24 25.14±5.80 25.46±9.79 34.37±8.07 35.92±10.05 HR 16 33.30±5.81 35.49±6.65 46.18±7.94 48.35±6.77 CH 60 2.64±1.13 6.27±2.38 3.17±1.01 4.56±1.21

2.5 各组间TIM-3+T细胞产生IL-2和IFN-γ的表达差异 见表5。AML不同疾病阶段患者的外周血和骨髓中CD4+TIM-3+T细胞和CD8+TIM-3+T细胞产生IL-2和IFN-γ细胞因子比较，HR患者外周血和骨髓产生IL-2和IFN-γ细胞因子表达水平明显低于HC组和ND组（F=5.841,5.017,均P＜0.001）。

表5 各组间TIM-3+T细胞IL-2和IFN-γ的表达[(±s)%]

表5 各组间TIM-3+T细胞IL-2和IFN-γ的表达[(±s)%]

注：ND vs HR, FND=8.172, 6.892, 5.268, 4.972, 5.175, 6.218, 3.768, 3.826, 均P＜0.01; HC vs HR, FHC=8.361, 7.028, 4.278, 4.279, 5.829, 6.170,4.926, 5.182, 均P＜0.001。

组别 n外周血IL-2 外周血IFN-γ 骨髓IL-2 骨髓IFN-γ CD4+PD1+ CD8+PD1+ CD4+PD1+ CD8+PD1+ CD4+PD1+ CD8+PD1+ CD4+PD1+ CD8+PD1+ND 45 22.15±10.24 14.29±7.15 19.15±7.85 49.87±16.78 24.46±11.21 13.15±4.54 18.58±9.57 54.58±19.25 CR 35 15.12±7.01 10.20±5.68 15.45±6.78 47.05±18.75 20.44±10.75 11.21±6.48 16.28±9.13 52.18±18.47 NR 24 14.46±7.12 7.05±3.18 14.54±8.45 46.45±15.26 20.21±10.32 10.02±5.48 15.22±10.14 50.66±18.44 HR 16 12.86±6.45 7.81±3.26 15.26±7.45 45.23±18.21 19.87±10.24 8.58±4.13 14.59±9.32 50.26±18.38 HC 60 23.26±10.48 15.06±7.64 19.57±8.61 49.12±19.15 25.45±12.14 14.22±7.32 19.40±10.52 55.87±19.22

3 讨论

急性髓系白血病（AML）是一种恶性血液肿瘤，治疗效果差，生存率低，目前新型免疫治疗是治疗AML的有效方法[7-8]。T细胞衰竭是机体在肿瘤持续的抗原刺激下出现的免疫状态低下，髓系白血病细胞的共刺激信号能够促进Th1细胞功能衰竭，通过上调PD1,TIM-3,LAG-3和CTLA-4等免疫位点，引起相应的IL-2,TNF-α和IFR-γ分泌减少，诱导T细胞衰竭[1,9-10]。Tex在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用，Tex可削弱机体的免疫，引起肿瘤细胞发生免疫逃逸反应和免疫攻击，促进肿瘤的生长和增殖。既往研究表明初诊AML患者骨髓中CD8+T淋巴细胞功能丧失与AML患者预后不良相关，主要与丧失肿瘤表面抗原、诱导T淋巴细胞的耗竭、触发免疫逃逸有关[8,11]。有研究提示白血病患者异基因造血干细胞移植后体内的Tex增多，能够预测其复发风险明显增多[12]。可见，免疫位点的免疫逃逸机制参与了肿瘤的发生发展过程。因此，逆转T细胞功能反应降低的免疫检查点可能是治疗AML患者有效的靶向免疫治疗方法。

AML患者中白血病细胞与抗原呈递细胞具有共同的细胞表面特征，能够与Th1细胞相互作用，上调T细胞的抗原受体T细胞（T cell receptor,TCR），触发T细胞增殖和减少细胞因子或趋化因子的分泌而发挥作用[11]。AML患者中PD1，TIM-3等常见免疫检查点可抑制免疫应答，诱发T细胞耗竭，导致免疫逃逸发生，参与该病的发病过程[13]。目前，多项研究已证实PD1及其他T细胞抑制性通路参与AML疾病进展，其中PD1是CD28受体家族的一个重要的抑制性免疫检测点，在活化的效应性T细胞（Teff细胞）和Tex细胞表面表达，包括PDL1和PDL2两个配体，在正常免疫反应状态下，PD1能阻止TCR活化信号通路的传递，具有抑制T细胞活化功能,发挥免疫逃逸作用[14-16]。TIM-3是Tex细胞表面的另一个重要的抑制性通路受体，而肿瘤的发生发展与TIM-3的高表达密切相关[17-20]。

为了检测AML患者外周血和骨髓中T细胞的免疫检查点（PD1和TIM-3）的表达情况与AML疾病发生发展的相关性。本研究发现，AML患者中外周血和骨髓中PD1和TIM-3表达明显增高，与既往研究一致[15,19]，表明PD1和TIM-3的表达上调与机体免疫功能下降和抗白血病能力下降有关，能够促进AML疾病的发生发展[15,19-21]。本研究提示骨髓中CD4+PD1+TIM-3+T和CD8+PD1+TIM-3+T细胞表达明显高于外周血，可能与AML患者骨髓微环境中存在更多的抑制性免疫因子、T细胞受损严重、免疫检查点的Tex水平表达增加有关[8,22-23]。在外周血和骨髓中，CD8+PD1+TIM-3+T细胞的表达量明显高于CD4+PD1+TIM-3+T细胞，提示AML患者疾病发展过程中CD8+细胞毒性T细胞功能受损更为严重。经治疗后获得CR的AML患者外周血和骨髓中PD1的表达均下降，能够有效提高机体的免疫功能，而NR和HR患者的T细胞表面的PD1和TIM-3明显增加，可能与AML患者治疗后出现白血细胞耐药和治疗疗效不佳有关。另外，HR患者外周血和骨髓中PD1+T和TIM-3+T细胞所产生IL-2和IFN-γ细胞因子表达水平明显低于对照组和ND患者，表明AML复发患者免疫功能低下，诱发T细胞耗竭，细胞因子的分泌减少，能够促进肿瘤的增殖分化。

综上所述，本研究通过检测AML不同疾病阶段患者的外周血和骨髓中CD4+PD1+TIM-3+T细胞和CD8+PD1+TIM-3+T细胞表达水平，研究发现，CR患者外周血和骨髓中CD4+/CD8+PD1+TIM-3+T细胞数量较ND患者明显减少，HR患者明显增多；与外周血标本比较，骨髓T细胞耗竭更为明显，外周血和骨髓中CD8+PD1+TIM-3+T细胞表达明显高于CD4+PD1+TIM-3+T；另外，HR患者外周血和骨髓中PD1+T细胞和TIM-3+T细胞所产生IL-2和IFN-γ细胞因子表达水平明显降低，提示AML复发患者存在T细胞耗竭水平明显增多，分泌的免疫性IL-2和IFN-γ细胞因子减少的现象，参与了疾病的发生发展。因而，在AML治疗过程中，动态监测PD1和TIM-3等免疫位点的表达水平变化，能够预测AML患者临床治疗疗效和疾病进展的预后判断。