DADS抑制XIAP介导的人胃癌HGC27细胞增殖、迁移和侵袭

刘芳， 李志敏， 曹振华， 何慧， 苏琦， 苏波

(南华大学衡阳医学院 1.肿瘤研究所，2.基础医学院应用解剖与生殖医学研究所，3.药学院药物药理研究所，湖南省衡阳市 421001)

胃癌是中国第二大常见癌症，是所有癌症类型中的第三大死因[1]。大蒜素的抗癌作用高于其他化疗药物，毒性和不良反应相对较小，二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)是由大蒜素分解的活性产物之一[2]。DADS具有抗胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用[3]。

X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)通过作用凋亡蛋白Caspases抑制凋亡、促进肿瘤细胞增殖，并且参与信号通路调节、促进肿瘤转移[4]。DADS抑制胃癌细胞XIAP表达[5]，本文在此基础上研究DADS是否通过下调XIAP抑制XIAP过表达胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

新生小牛血清(杭州四季青生物工程公司)；嘌呤霉素(Invitrogen公司)；DADS(Sigma公司)；CCK-8细胞增殖检测试剂盒(Dojindo公司)；BCA蛋白定量试剂盒(Promega公司)；抗XIAP、β-actin抗体(Abcam公司)；ECL发光试剂盒(Santa Cruz公司)；Matrigel基质胶(BD公司)。

1.2 细胞培养和XIAP过表达细胞株构建

人胃癌HGC27细胞(中山大学肿瘤防治中心馈赠)置于5%CO2、饱和湿度的37 ℃培养箱，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基培养。GV358慢病毒空载体(Vector)和XIAP过表达载体(XIAP)购自上海吉凯基因公司。胃癌细胞接种于24孔板，将XIAP-GV358慢病毒转染HGC27细胞，48 h后倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表达情况；用嘌呤霉素(0.3 mg/L)筛选稳定转染的细胞株；以未转染(Control组)和Vector组为对照，Western blotting鉴定XIAP表达。过表达实验分为Vector组、Vector+DADS组、XIAP组、XIAP+DADS组。Vector组、XIAP组未用DADS处理，Vector+DADS组、XIAP+DADS组DADS(30 mg/L)处理24 h。

1.3 Western blotting

用RIPA溶液4 ℃裂解细胞，提取蛋白，BCA法检测蛋白水平，各组取等量样本凝胶电泳，转移至PVDF膜，置于脱脂牛奶封闭1 h，4 ℃孵育一抗过夜，TBST洗膜3次，二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，加ECL发光液，X片曝光、显影、定影。扫描灰度值，以β-actin作为内对照计算相对蛋白表达水平。

1.4 MTT检测

96孔板中接种各组细胞，每组设置6个重复孔，用DADS(30 mg/L)处理细胞24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液后置于培养箱2 h，酶联免疫检测仪中测定OD450值。细胞增殖率(%)=[(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%。

1.5 平板克隆形成实验

6孔板中接种各组细胞，每孔200个细胞，每组设置3个重复孔，处理细胞后放置培养箱培养14天，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，自然风干后用结晶紫染色。克隆形成率(%)=(克隆数/接种细胞数)×100%。

1.6 迁移和侵袭实验

在Transwell上层小室接种各组细胞，将1640培养基(含10%胎牛血清)加入下室，DADS(30 mg/L)处理细胞24 h后，拭去小室上层膜表面的细胞，用4%多聚甲醛溶液固定小室下表面的细胞，结晶紫溶液(0.1%)染色。倒置显微镜下随机选择4个高倍视野，计数迁移的细胞数量，计算平均值。进行侵袭实验前，将Matrigel基质胶铺在小室上层膜表面，之后的实验步骤与上述迁移实验相同。

1.7 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件。数据用均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 XIAP过表达胃癌HGC27细胞株的建立及鉴定

HGC27细胞转染慢病毒48 h后，光学显微镜下观察到细胞状态良好，荧光显微镜下观察到GFP荧光信号强，提示XIAP-GV358慢病毒载体转染细胞效率较高(图1A)；继续用嘌呤霉素筛选细胞株2周，Western blotting鉴定Control组、Vector组、XIAP组的XIAP蛋白表达情况，结果显示XIAP组蛋白水平明显高于Control和Vector组(P<0.05；图1B)，成功建立XIAP稳定过表达HGC27细胞株。

图1 慢病毒转染HGC27细胞及Western blotting检测XIAP表达A为光学显微镜下(左)和荧光显微镜下(右)观察慢病毒转染的HGC27细胞；B为Western blotting检测XIAP表达。a为P<0.05，与Control组和Vector组比较。

2.2 DADS对胃癌HGC27细胞XIAP表达的影响

Vector+DADS组XIAP蛋白水平低于Vector组(P<0.05；图2)；XIAP+DADS组XIAP蛋白水平高于Vector+DADS组，但低于XIAP组(P<0.05)。

图2 DADS对胃癌HGC27细胞XIAP表达的影响1为Vector组；2为Vector+DADS组；3为XIAP组；4为XIAP+DADS组。a为P<0.05，与Vector组比较；b为P<0.05，与Vector+DADS组和XIAP组比较。

2.3 DADS对XIAP过表达胃癌HGC27细胞增殖及克隆的影响

Vector+DADS组细胞增殖率呈时间依赖性下降(P<0.05；表1)；与Vector组比较，Vector+DADS组增殖率、克隆形成率降低，而XIAP组增殖率、克隆形成率升高；XIAP+DADS组细胞增殖率、克隆形成率高于Vector+DADS组，低于XIAP组(P<0.05；表1和图3)。

2.4 DADS对XIAP过表达胃癌HGC27细胞迁移及侵袭的影响

与Vector组比较，细胞迁移、侵袭数量Vector+DADS组明显减少，XIAP组增加(P<0.05)；XIAP+DADS组细胞迁移、侵袭数量高于Vector+DADS组，低于XIAP组(P<0.05；表2和图4)。

表1 DADS对XIAP过表达HGC27细胞增殖的影响 单位：%

图3 DADS对XIAP过表达HGC27细胞克隆形成的影响1为Vector组；2为Vector+DADS组；3为XIAP组；4为XIAP+DADS组。a为P<0.05，与Vector组比较；b为P<0.05，与Vector+DADS组和XIAP组比较。

表2 DADS对XIAP过表达HGC27细胞迁移和侵袭的影响 单位：个

图4 DADS对XIAP过表达HGC27细胞迁移及侵袭的影响(结晶紫染色，40×)

3 讨 论

胃癌的早期诊断和治疗可提高患者生存率[6]，但因复发和转移，患者预后差[7]。研究干预胃癌发生的药物对于胃癌防治具有重要意义。

XIAP表达与胃癌生长、侵袭和转移具有相关性，癌组织XIAP表达较高的患者预后较差，说明XIAP与胃癌临床进展密切相关[8]。本实验结果显示，XIAP过表达增强胃癌HGC27细胞增殖和迁移侵袭能力，证实XIAP表达增高可促进胃癌细胞恶性表型。Li等[8]报道，siRNA下调XIAP表达可抑制HGC27细胞增殖、诱导凋亡。Sun等[9]发现XIAP是MicroRNA-509-3p作用靶点，后者抑制胃癌HGC27和MKN45细胞迁移和侵袭能力。上述研究表明，下调XIAP是抗胃癌增殖和转移潜能的有效策略。

DADS可干预多条信号通路、发挥肿瘤防治作用，它通过下调癌基因、上调抑癌基因诱导细胞周期阻滞，抑制增殖[10]。DADS诱导G2/M期阻滞可抑制胃癌干细胞增殖[11]。本实验室通过差异蛋白质谱分析发现，DADS影响LIMK1、RORα、XIAP等多个基因表达[5]，证实DADS下调LIMK1、上调RORα可诱导G2/M期阻滞、抑制胃癌细胞增殖[3]。本实验在证实过表达XIAP促细胞增殖的基础上，进一步明确DADS通过下调过表达细胞XIAP表达、抑制胃癌HGC27细胞增殖。文献报道，XIAP抑制剂可干预JAK/STAT、PI3K/Akt、p53、p38等信号通路，发挥抗胃癌生长的作用[12]；大麻酚下调XIAP表达可抑制胃癌细胞增殖、诱导凋亡[13]。XIAP参与多条信号通路的调节，DADS可能通过抑制XIAP表达影响其介导的促胃癌细胞增殖的信号通路。

转化生长因子-β(transforming growth factor，TGF-β)可通过非Smad依赖性信号通路诱导肿瘤细胞由上皮细胞向间质细胞转化(EMT)，使肿瘤细胞获得转移能力[14]。XIAP介导TGF-β诱导食管癌细胞EMT，增强其迁移侵袭能力[15]。本实验结果证实，XIAP过表达可增强HGC27细胞迁移侵袭能力，而DADS下调过表达细胞XIAP的表达、降低细胞迁移和侵袭能力。前期研究证实，DADS通过抑制EMT降低胃癌细胞迁移侵袭能力[3]；DADS下调TGF-β可抑制EMT相关信号通路分子Rac1和β-catenin表达[16]。DADS可能通过下调XIAP抑制TGF-β诱导胃癌细胞EMT，从而使XIAP介导的细胞迁移侵袭能力降低。