复方开口箭合剂对乳腺癌生长转移的影响*

王秀萍，叶太生，艾望，周珍，张莹雯

1.武汉大学中南医院，湖北 武汉 430071；2.武汉大学，湖北 武汉 430000

乳腺癌是威胁女性健康最常见的恶性疾病之一，近几年在我国的发病率快速上升，每年新发患者数居全球第一[1]。据世界卫生组织(world health organizatio，WHO)统计，全球每年约有140万名新发乳腺癌患者[2]。中医认为，恶性肿瘤的发生与正气不足、癌毒邪气趁虚入侵密切相关。导师张莹雯教授长期从事恶性肿瘤的临床基础研究，依据其多年的临床经验，总结出治疗乳腺癌的经验方复方开口箭合剂，临床使用效果良好。雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，在乳腺癌的发生、发展、转移及耐药等多方面均发挥重要的调控作用。本研究拟考察复方开口箭合剂体内抑制乳腺癌增殖、转移作用及其对mTOR表达的影响，进一步探讨其抑制乳腺癌增殖转移的作用机制。

1 材料

1.1 动物及细胞株6周龄SPF级雌性BALB/C小鼠，体质量(20±2) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006。小鼠饲养于武汉大学中南医院SPF级动物实验中心，环境温度20～26 ℃，湿度60%～70%，光照 12 h。4T1高转移小鼠乳腺癌细胞株(简称：4T1细胞株)，由武汉大学肿瘤病理实验中心赠送。

1.2 药物与试剂开口箭、茯苓、黄芪、伸筋草、丝瓜络、昆布、浙贝母、白花蛇舌草、三棱、水蛭、郁金、夏枯草、莪术、红藤、蒲公英、皂角刺(武汉大学中南医院草药房)；依维莫司(美国MCE公司，货号：HY-10218)。Trizol试剂(美国ambion公司，货号：15596026)；SYBR Green PCR试剂盒(美国KAPA Biosystems公司，货号：KM4101)；逆转录试剂盒(大连TAKARA 公司，货号：639505)；DNase I(加拿大Fermentas公司，货号：EN0521)；DEPC处理水(武汉华联科生物技术有限公司，货号：PAB180005)；氯仿、异丙醇、无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，货号：10006818、80109218、10009218)。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 仪器SW-CJ-2D型超净工作台(苏州净化设备有限公司)；MLS-3781L-PC型高压灭菌锅(日本 Panasohic公司)；微量移液枪(各种型号，美国 Rainin PiPet-Lite公司)；G80F20CN1L-DG(W0)型微波炉(广东格兰仕集团有限公司)；Centrifuge 5424 R型离心机(德国 Eppendorf公司)；T100-Thermal Cycler型PCR仪、CFX-96型荧光定量PCR仪、DYC-31D型水平电泳设备、Universal Hood II型凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)；DHG-924385-III型恒温鼓风干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)；HH-W600型数显恒温水浴锅(常州市国旺仪器制造有限公司)；XW-80A型微型涡旋混合仪(上海青浦泸西仪器厂)；ULUPURE 型优普特实验室超纯水仪(法国 MilliPORE公司)；DHP-9052型37 ℃恒温培养箱(上海齐欣科学仪器有限公司)。

2 方法

2.1 药物制备按量称取复方开口箭合剂各药材，生药浸水1 h，煮沸40 min，过滤后的药渣再次加水煮沸，合并2次煎煮液，水浴浓缩为最终浓度分别是1.5 g·mL-1、3 g·mL-1、6 g·mL-1的复方开口箭合剂溶液，置4 ℃冰箱备用。

2.2 模型制备、分组与给药60只BALB/C小鼠随机分为空白对照组、模型组、依维莫司组及复方开口箭合剂高、中、低剂量组，每组10只。取对数生长期的4T1细胞制备成细胞密度为1×106mL-1的细胞悬液，除空白对照组外，其余组小鼠均乳垫下接种50 μL细胞悬液，建立乳腺癌模型[3-4]，空白对照组乳垫下注射等量生理盐水。以注射部位出现肉眼可见或可触及不规则结节为造模成功。造模成功次日开始给药，复方开口箭合剂高、中、低剂量组分别以10 mL·kg-1的体积灌胃给予浓度为6 g·mL-1、3 g·mL-1、1.5 g·mL-1的复方开口箭合剂溶液，空白对照组及模型组灌胃给予等体积生理盐水，每日1次；依维莫司组腹腔注射2 mg·kg-1的依维莫司，每周2次[5]。

2.3 瘤质量及抑瘤率检测给药7 d后，各组随机选取5只小鼠处死，取原位瘤(空白对照组小鼠取乳腺组织，排除原发性肿瘤对数据造成的影响)，称其质量。其余小鼠给药14 d后处死，取原位瘤，称其质量。各组小鼠的瘤质量取平均值，计算抑瘤率。

抑瘤率(%) = (模型组瘤质量-实验组瘤质量) /模型组瘤质量×100%[6]

2.4 肺转移结节数及肺转移抑制率检测各组小鼠分两批分别于给药7 d和给药14 d后处死，取肺组织，经体积分数4%多聚甲醛固定48 h后连续切片，显微镜下观察肺转移结节情况，计数结节数目，取各组平均值计算肺转移抑制率。

肺转移抑制率(%)=(模型组结节数-治疗组结节数)/模型组结节数×100%[7]

2.5 瘤组织mTORmRNA测定采用RT-PCR测定乳腺原位瘤组织mTORmRNA的表达水平。取瘤组织100 mg于研磨器内，研磨后倒入含1 mL Trizol的匀浆管中，匀浆 20 s，待其充分混匀后放于冰上静置5 min，12 000 r·min-1离心10 min。取上清，加入氯仿200 μL，混匀后于4 ℃静置2 min，12 000 r·min-1离心10 min；取上清，加入约 0.5 mL 异丙醇，混匀后于4 ℃静置15 min，12 000 r·min-1离心15 min，弃上清；沉淀物中加入预冷的75%乙醇 1 mL 进行洗涤，7 500 r·min-1离心5 min，弃上清，重复洗涤一次，室温干燥约10 min，即为提取出的RNA；在管中加入DEPC水40 μL，使RNA充分溶解。根据逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA。PCR扩增体系：SYBR Green Mix预混液 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O补至20 μL。扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性5 s；56 ℃退火10 s；72 ℃延伸25 s，进行39个循环。以GAPDH为内参，计算目的基因的表达水平。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

3 结果

3.1 复方开口箭合剂对乳腺原位癌生长的影响瘤质量检测结果表明：空白对照组小鼠均未发现原发性肿瘤。与给药7 d后比较，给药14 d后，模型组及复方开口箭低剂量组小鼠的瘤质量显著增加(P<0.05)；依维莫司组及复方开口箭合剂中、高剂量组小鼠的瘤质量显著降低(P<0.05)。与模型组比较，各给药组小鼠的瘤质量均显著降低(P<0.05)。与依维莫司组比较，给药7 d后，复方开口箭合剂低、中剂量组小鼠的瘤质量均显著升高(P<0.05)；给药14 d后，复方开口箭合剂高剂量组小鼠的瘤质量显著降低(P<0.05)，而复方开口箭合剂低、中剂量组小鼠的瘤质量均显著升高(P<0.05)。与复方开口箭合剂高剂量组比较，复方开口箭合剂中、低剂量组小鼠瘤质量均显著增加(P<0.05)。与复方开口箭合剂中剂量组比较，复方开口箭合剂低剂量组小鼠瘤质量均显著增加(P<0.05)。抑瘤率检测结果表明：给药7 d后，各组的抑瘤率范围为 6.67%～18.67%；给药14 d后，各组的抑瘤率均有所提高，范围为14.44%～47.78%。见表2。

表2 各组小鼠乳腺原位瘤质量及抑瘤率比较

3.2 复方开口箭合剂对乳腺癌肺转移的影响肺转移结节数检测表明：空白对照组小鼠乳腺癌未发现肺转移。与给药7 d后比较，给药14 d后模型组及复方开口箭合剂中、低剂量组小鼠肺组织中转移性结节数显著增加(P<0.05)，复方开口箭合剂高剂量组小鼠肺组织中转移性结节数显著减少(P<0.05)。与模型组比较，给药7 d和14 d后依维莫司组与复方开口箭合剂高、中剂量组小鼠肺组织中转移性结节数显著减少(P<0.05)；给药14 d后，复方开口箭合剂低剂量组小鼠肺组织中转移性结节数显著减少(P<0.05)。与依维莫司组比较，复方开口箭合剂高剂量组小鼠肺组织中转移性结节数显著减少(P<0.05)，而复方开口箭合剂中、低剂量组小鼠肺组织中转移性结节数增加(P<0.05)；与复方开口箭合剂高剂量组比较，复方开口箭合剂中、低剂量组小鼠肺组织中转移性结节数增加(P<0.05)。肺转移抑制率检测结果表明：给药7 d后，各组小鼠的肺转移抑制率范围为1.61%～14.52%；给药14 d后，各组的肺转移抑制率均有所提高，范围为6.82%～38.64%。见表3。

表3 各组小鼠乳腺癌肺转移结节数及肺转移抑制率

3.3 复方开口箭合剂对乳腺原位瘤组织mTORmRNA表达的影响与给药7 d后比较，给药14 d后，依维莫司组及复方开口箭合剂高、低剂量组小鼠乳腺原位瘤组织内mTORmRNA的表达水平显著降低(P<0.05)；与空白对照组比较，模型组及各给药组小鼠乳腺原位瘤组织内mTORmRNA的表达水平均显著升高(P<0.05)。与模型组比较，各给药组小鼠乳腺原位瘤组织内mTORmRNA的表达水平均显著降低(P<0.05)。与依维莫司组比较，给药7 d后，复方开口箭合剂各剂量组小鼠乳腺原位瘤组织内mTORmRNA的表达水平均显著升高(P<0.05)；给药14 d后，复方开口箭合剂中、低剂量组小鼠乳腺原位瘤组织内mTORmRNA的表达水平均显著升高(P<0.05)。见表4。

表4 小鼠原位瘤组织内mTOR mRNA相对表达情况

4 讨论

乳腺癌属于中医学“乳疽”“乳岩”“乳核”等范畴。公元350年，东晋·葛洪在石廱上记载：“乳中隐核、不痛不痒、底结肿坚如石……”，隋代《诸病源候论·乳石痈候》中记述：“石痈之状，微强不甚大，不赤微痛痒……但结核如石”，均概述了本病的特征。中医认为，乳腺癌的病因病机主要为正气虚弱、癌毒邪气趁虚入侵[8-9]。《医宗必读》记载：“积之成也，正气不足，而后邪气踞之。”指出正气不足，既不能抵抗外邪入侵又不能祛邪外出，邪气聚集滞而成瘤，认为“正虚”是肿瘤发生的根本原因。《诸病源候论》云：“有下于乳者，其经虚，为风寒气客之，则血涩结……无大热，但结核如石。”指出外邪乘虚入内聚于乳络，寒凝血涩，气血运行不畅，瘀血内停，积久成岩。癌毒是导致乳腺癌发生发展的关键，既可直接外客，亦可因脏腑机能失调而内生[10-11]。癌毒阻滞，病变乖戾，耗伤人体气血津液以自养，并可诱生湿、热、痰、瘀等多种病理因素。

针对乳腺癌的病因病机及病理特点，导师张莹雯教授依据多年的从医经验，采用复方开口箭合剂用于乳腺癌的临床治疗，可有效控制病情，减少并发症，延长患者生存期。复方开口箭合剂由开口箭、茯苓、黄芪等16味中药组成。方中开口箭，味苦辛，性寒，清热解毒，为君药，前期研究中证实其对甲状腺髓样癌细胞具有抑制作用[12-13]；浙贝母苦寒，昆布咸寒，夏枯草辛苦寒，白花蛇舌草苦甘、性寒，四药助开口箭清热解毒、软坚散结，为臣药；黄芪甘温，合茯苓益气托毒、利水渗湿；三棱、莪术、水蛭、郁金行气破血、消积；伸筋草、丝瓜络祛风通络；红藤、蒲公英、皂荚刺托毒消肿，共为佐药。为进一步明确其抗乳腺癌作用及机制，本实验采用接种4T1乳腺癌细胞株的方法建立乳腺癌模型，以高、中、低剂量复方开口箭合剂进行干预，发现复方开口箭合剂可有效抑制乳腺癌的生长、转移，其作用呈时间、剂量依赖性。在给药7 d后，高剂量复方开口箭合剂对乳腺原位癌生长的抑制作用并无明显优势，但可更好地抑制肺转移；在给药14 d后，高剂量复方开口箭合剂的抑瘤率可达47.78%，肺转移抑制率为53.41%，在抑制乳腺原位癌生长、肺转移上效果均优于用于中晚期乳腺癌治疗药物依维莫司(选择性mTOR抑制剂)[14-16]。依据中草药抗肿瘤有效性标准及《现代肿瘤治疗药物学》相关标准：抑瘤率 >30%被认为有效[17-18]，本实验结果证实，给药14 d后，高、中剂量复方开口箭合剂对4T1乳腺原位癌生长具有有效的抑制作用，其中高剂量复方开口箭合剂还可有效抑制乳腺癌的肺转移。

mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可调节细胞凋亡与自噬，参与肿瘤细胞的生长、代谢、侵袭、转移等重要环节。已有研究发现，mTOR信号通路在包括乳腺癌、肝癌、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤中过度激活，促进肿瘤细胞生长，增加细胞侵袭力，与恶性肿瘤的发生发展、转移、不良预后密切相关[19-24]。研究认为，针对mTOR的治疗可能是乳腺癌尤其是中晚期乳腺癌的一个有效应对策略[25-27]。本研究发现，依维莫司在给药7 d后可较好的抑制mTORmRNA的表达，且随着作用时间的延长，在给药14 d后抑制作用增强，但其抑制乳腺癌肺转移作用并未同步增强。复方开口箭合剂亦可有效下调mTORmRNA的表达，其作用与用药时间、剂量呈正相关，虽然给药7 d后复方开口箭合剂下调mTORmRNA表达的作用明显弱于依维莫司组，但在给药14 d后，复方开口箭合剂高剂量组较之依维莫司组mTORmRNA表达无明显差异，并可更好的抑制乳腺原位癌的生长及肺转移。

综上所述，复方开口箭合剂可能部分通过下调mTOR的表达抑制乳腺癌的生长及肺部转移。依维莫司作为mTOR靶向抑制剂，虽可较好的抑制mTOR的表达，但单独使用依维莫司对乳腺癌生长转移的抑制作用低于高剂量复方开口箭合剂，提示乳腺癌的发生发展是多因素综合作用的结果，应从多方面着手综合治疗，复方开口箭合剂可能还通过其他途径发挥抗乳腺癌作用，其具体机制有待进一步研究。