基于网络药理学与分子对接技术探讨六味地黄丸治疗抑郁症的作用机制*

张俊霞，晁利芹，王付

河南中医药大学，河南 郑州 450046

抑郁症是一种严重危害人类健康的精神情感障碍性疾病[1]，临床常表现为情绪低落、反应迟钝、思维活动减退、失眠等精神症状，其病位主要在脑部。现代研究表明，抑郁症与诸多因素相关，如炎性因子分泌、神经递质表达异常、神经细胞通路改变、下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)持续紊乱、肠道菌群改变、线粒体结构异常等[2-4]。目前，西医治疗主要以服用抗抑郁药物为主，短期疗效尚可，但长期服用不良反应较多[5-6]。

抑郁症作为现代医学名词，在中医学归属于“郁病”范畴。近年来，随着中医药在抑郁症方面的深入研究，越来越多研究证实中药、中药复方可通过多靶点、多机制、多途径来调节并改善抑郁症[7-9]。中医学认为，脑为髓之海，肾为生髓之器，脑部疾病采用补肾之法，疗效显著。宋代钱乙的六味地黄丸作为补肾经典方剂具有“三补与三泻”的特点，熟地黄、山药、山茱萸补则益精填髓、滋水涵木，牡丹皮、泽泻、茯苓泻则平肝、疏肝、柔肝[10-11]。本研究应用网络药理学和分子对接技术，构建“药物活性成分-潜在作用靶点-信号通路”网络，探究六味地黄丸治疗抑郁症的潜在靶点及其作用机制，为其进一步研究奠定基础。

1 资料与方法

1.1 六味地黄丸药物活性成分及其相关靶点筛选采用中药系统药理学数据库与分析平台(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)检索六味地黄丸组方中熟地黄、山药、山茱萸、牡丹皮、泽泻、茯苓的化学成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≧30%、类药性(drug likeness，DL)≧0.18、血脑屏障(blood brain barrier，BBB)≧-0.3为条件对所获得的化学成分进行筛选，得到符合条件的活性成分。运用PubChem数据库(https：// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、BABEL软件、SwissTargetPrediction数据库(http：//www.swisstargetprediction.ch/)、SEA在线平台(http：//sea.bkslab.org/)预测活性成分的相应靶点，并使用Uniprot数据库(http：// www.uniprot.org/)将得到的靶点蛋白进行名称规范整理[12-14]。

1.2 六味地黄丸治疗抑郁症的潜在靶点预测使用DisGeNET数据库(https：//www.disgenet.org/)获取抑郁症的疾病靶点，并运用Venn Diagram平台(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)对六味地黄丸活性成分相关靶点及抑郁症疾病靶点进行映射，得到交集靶点，即为六味地黄丸治疗抑郁症的潜在作用靶点。

1.3 蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络构建将六味地黄丸治疗抑郁症的潜在作用靶点输入 STRING数据库(https：//STRING-db.org/)，物种限定为人，设定置信度阈值≥0.9。将结果中的 node 1、node 2 数据信息输入 Cytoscape 3.2.1 软件进行数据可视化分析并构建 PPI 网络，根据 PPI 网络中节点(node)度值(degree)的大小，筛选出关键靶点。

1.4 FunRich功能富集分析将六味地黄丸治疗抑郁症的潜在作用靶点输入FunRich软件，物种限定为人，设定P值≤0.01，进行功能富集分析。

1.5 “药物活性成分-潜在靶点”网络构建将六味地黄丸治疗抑郁症的潜在作用靶点与六地黄丸相关活性成分进行关联，导入 Cytoscape 3.2.1 软件，构建“药物活性成分-潜在靶点”网络图，并进行拓扑分析筛选出关键成分[15-16]。

1.6 分子对接应用DockThor软件将PPI 网络中度值首位的靶点蛋白分别与六味中药中拓扑分析参数首位的活性成分进行分子对接验证(如果拓扑参数中的首位活性成分在PubChem 数据库无法得到三维结构，将依序顺接选择相应活性成分)。从RCSB PDB 蛋白质结构数据库(http：// www.rcsb.org/ pdb/home/home.do)获得靶点蛋白的结构，并从PubChem数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中获得活性分子化合物的三维结构，采用DockThor平台(https：// dockthor.lncc.br/v2/)对靶点蛋白和活性成分进行分子对接，得到结合能值 (affinity)，数值越小结合力越强。将所得结果导入PyMOL软件，进行可视化绘图分析。

2 结果

2.1 六味地黄丸活性成分及其相关作用靶点通过TCMSP获得六味地黄丸化学成分508个，其中熟地黄76个，山药71个，山茱萸226个，牡丹皮55个，泽泻46个，茯苓34个。以OB≥30%、DL≥0.18、BBB≥-0.3为条件进行筛选后，获得六味地黄丸活性成分40个，其中熟地黄2个，山药12个，山茱萸14个，牡丹皮3个，泽泻3个，茯苓6个。运用PubChem数据库、BABEL软件、SwissTargetPrediction数据库、SEA平台得到活性成分相关靶点 3 706 个，其中熟地黄200个，山药1 100个，山茱萸1 303个，牡丹皮203个，泽泻300个，茯苓600个。

2.2 六味地黄丸治疗抑郁症的潜在作用靶点使用DisGeNET数据库获取抑郁症疾病靶点1 478个。运用Venn Diagram平台对六味地黄丸活性成分相关靶点与抑郁症疾病靶点进行映射，得到抑郁症疾病靶点与六味地黄丸活性成分相关靶点的交集靶点38个。

2.3 PPI网络构建与分析将抑郁症疾病靶点与六味地黄丸活性成分相关靶点的交集靶点导入 STRING数据库中获取靶点蛋白相互作用关系，导入Cytoscape 3.2.1软件绘制 PPI 网络图，该网络图共有38个节点和101条边，其中圆形表示蛋白质，圆形内为蛋白质的3D结构，边代表蛋白之间的关联。筛选出重要的子网络，根据拓扑参数筛选得到丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)为首位关键靶点。见图1、图2及表1。

表1 PPI网络子网络靶点拓扑分析参数

图1 PPI网络图

图2 PPI网络主要靶点的子网络图

2.4 “药物活性成分-潜在靶点”网络将六味地黄丸治疗抑郁症的潜在作用靶点与六地黄丸相关活性成分进行关联，导入 Cytoscape 3.2.1 软件，构建“药物活性成分-潜在靶点”网络图，并进行拓扑分析筛选出关键成分。见表2。

表2 “药物活性成分-潜在靶点”网络拓扑分析参数

2.5 富集分析将38个交集靶点输入FunRich软件进行功能富集分析，得到生物过程13个，包括蛋白质代谢、新陈代谢、能量途径、转运、细胞通路、信号转导、神经递质代谢、核酸酶调控、核苷、核苷酸和核酸代谢、基因表达调控、骨重建、G蛋白偶联受体蛋白信号通路、激素代谢、转录；细胞组分37个，主要包括细胞质、细胞膜等；分子功能15个，主要包括转录因子活性、转运体活性、氧化还原酶活性等；通路有319条，主要包括Cdc42活性调节通路、质膜雌激素受体信号传导通路等。见图3-图6。

图3 生物过程富集分析图

图4 细胞成分富集分析图

图5 分子功能富集分析图

图6 生物通路富集分析图

2.6 分子对接将靶点蛋白MAPK3分别与六味中药拓扑分析参数值首位的活性成分进行分子对接验证。若结合能<0，表明配体分子能和受体蛋白自发地结合；结合能<-5.0 kJ·mol-1，表明其结合性好，结合能越小对接越好[17]。采用PyMOL软件做可视化处理。黄色虚线代表氢键，与氢键结合的氨基酸处理成红色。分子对接发现，化合物均稳定地位于对接口袋内。豆固醇与活性位点附近的氨基酸PRO-347形成氢键结合到MAPK3。薯蓣皂苷与活性位点附近的3个氨基酸ASN-138、GLU-171、ARG-78形成氢键结合到MAPK3。丁子香萜与活性位点附近的2个氨基酸GLU-328、ARG-15形成氢键结合到MAPK3。[(1S，3R)-1-[(2R)-3，3-dimethyloxiran-2-yl]-3-[(5R，8S，9S，10S，11S，14R)-11-hydroxy-4，4，8，10，14-pentamethyl-3-oxo-1，2，5，6，7，9，11，12，15，16-decahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl]butyl]acetate与活性位点附近的3个氨基酸LYS-328、ARG-38、ARG-78形成氢键结合到MAPK3。麦角甾烷-7，22-二烯-3β-醇与活性位点附近的氨基酸PRO-347形成氢键结合到MAPK3。见表3、图7。

表3 六味地黄丸活性成分与MAPK3的分子对接结果

注：A-F：熟地黄、山药、山茱萸、牡丹皮、泽泻、茯苓中的活性成分与MAPK对接图；蓝色线条：化合物分子；红色线条：与化合物相连的氨基酸；虚线：化合物与蛋白质相连的氢键图7 重要活性成分与核心靶点的分子对接图

3 讨论

近年来，关于六味地黄丸临床应用研究的探讨逐渐引起关注[18-21]，多围绕在抗炎、抗氧化应激、抑制PKC活性、调节多元醇通路、改善细胞损伤等方面[22-25]，关于六味地黄丸抗抑郁的作用机制研究较少。目前，抑郁症的发病机制尚未完全阐明，而六味地黄丸复方成分复杂。为全面了解六味地黄丸治疗抑郁症的作用机制，本研究运用网络药理学和分子对接技术探讨六味地黄丸治疗抑郁症的作用机制。

研究发现，六味地黄丸的活性成分40个，治疗抑郁症的相关靶点38个，充分证明了六味地黄丸治疗抑郁症多成分、多靶点的作用特点。六味地黄丸治疗抑郁症的潜在靶点蛋白PPI网络图中共有38个节点、101条边，各靶点间存在多种相互作用，其中靶点的自由度越大，表明六味地黄丸通过该靶点治疗抑郁症的可能性越大，根据拓扑参数筛选得到MAPK3为首位关键靶点。根据“药物活性成分-潜在靶点”网络拓扑参数分析得出，熟地黄主要作用成分是豆固醇、谷固醇；山药关键作用成分是薯蓣皂苷、异岩藻糖甾醇、豆固醇、山酮C、海风藤酮、玉兰脂素B、山蒟醇、荜茇宁等；山茱萸主要有效成分为2，6，10，14，18-五甲基肼-2，6，10，14，18-五烯、康努达尼酮、亚麻酸乙酯、豆甾醇、邻苯二甲酸二异辛酯、谷甾醇、β-谷甾醇等；牡丹皮的主要有效成分是丁子香萜、谷甾醇；泽泻主要的有效成分是[(1S，3R)-1-[(2R)-3，3-dimethyloxiran-2-yl]-3-[(5R，8S，9S，10S，11S，14R)-11-hydroxy-4，4，8，10，14-pentamethyl-3-oxo-1，2，5，6，7，9，11，12，15，16-decahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl]butyl]acetate、乙酰泽泻醇B、谷甾醇；茯苓的主要有效成分是麦角甾烷-7，22-二烯-3β-醇、麦角甾醇过氧化物、3β-羟基-24-亚甲基-8-羊毛脂烯-21-油酸、去氢齿孔酸、常春藤皂甙元、氢化松苓酸。以上结果可以看出，熟地黄、山药、山茱萸均含有有效成分豆固醇，熟地黄、山茱萸、牡丹皮、泽泻均含有有效成分谷固醇，与已有研究结果一致[26]。推测这些含有相同成分的中药可能具有中药配方的协同作用，其他中药可能发挥相使作用。六味地黄丸组方中每味中药的重要成分与MAPK3进行分子对接发现，熟地黄、山药、山茱萸、牡丹皮、泽泻、茯苓的中药活性成分与MAPK3的结合能均小于-7.0 kJ·mol-1，表明六味地黄丸组方中药中的活性成分能高效结合抑郁症的靶点，从而发挥治疗作用。

通过FunRich软件对六味地黄丸治疗抑郁症的38个交集靶点进行富集分析得出，六味地黄丸治疗抑郁症参与的生物过程有13个，包括神经递质代谢，信号传导，能量通道、运输、细胞通讯，蛋白质代谢，调节核酸碱基、核苷、核苷酸和核酸代谢，调节基因表达的表观遗传，骨重塑，G蛋白耦合的受体蛋白信号通路，激素代谢、转录；信号通路319条，主要包括Cdc42活性调节通路，Cdc42信号，细胞膜雌激素受体信号等；细胞成分37个，主要包括胞质，胞质膜等；分子功能15个，主要包括转录因子活性，转运体活性，氧化还原酶活性等。

研究发现，抑郁症的发生可能与神经递质相关[27-28]，患者脑内神经递质分泌不足导致自主神经功能严重失调。神经递质主要有5-HT、NE、DA等单胺类和GABA、谷氨酸等氨基酸类，是维持神经回路的物质基础[29]。本课题研究发现，六味地黄丸治疗抑郁症的生物过程含有神经递质代谢过程，这与已有文献报道结果一致。

综上所述，本研究利用网络药理学和分子对接技术初步揭示了六味地黄丸治疗抑郁症的作用机制，为其临床应用提供了一定理论依据，同时为中医药治疗抑郁症疾病提供了新思路。