白头翁汤对人工感染鸡大肠杆菌病的治疗效果研究

吕颜枝，陈永亮，王善辉

（徐州生物工程职业技术学院，江苏徐州 221006）

调查显示，家禽肠道疾病是危害家禽养殖业的主要问题之一，可造成严重的经济损失，其流行具有病原种类复杂，血清型多样，毒力强、易变异，混合感染和继发感染普遍等特点，其中以大肠杆菌为首（吕颜枝等，2020）。中兽医认为，家禽大肠杆菌病属于外感温热病，符合卫气营血辨证，病邪依次进入卫分、气分、营分和血分，由表及里、逐渐加重的发展趋势，对该病辨证论治，确定治则以清热解毒为主，以凉血止痢、清肝泻火为辅（张丁华，2010）。方剂白头翁汤（Pulsatilla Decoction，PD）以白头翁为君药，发挥清热解毒、凉血止痢的功效，黄连、黄柏和秦皮是臣佐药，发挥君药发挥清热解毒、燥湿治痢的功效（马琪，2018）。PD 中的主要药物成分包含香豆素类，生物碱类，柠檬苦素类和皂苷类等，能发挥抗菌、抗炎和修复溃疡、免疫调节和抗腹泻等药理作用。王丽等（2020）、胡越等（2020）研究表明，PD 提取物可降低痢疾杆菌DNA 含量，能通过调控一些细胞因子等来治疗溃疡性结肠炎。杨雪贞等（2020）、马俊萍（2020）、李文超等（2010）对PD 在家禽疾病治疗方面的研究表明，禽巴氏杆菌对PD 高度敏感，PD 和白头翁抗球虫效果比较强，并对球虫孢子化卵囊有一定的抑制作用。因此，本文在前期研究的基础上（吕颜枝等，2021），对PD 的体内外抗鸡大肠杆菌作用进行了相关试验，为中药在兽医临床中的使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料准备

1.1.1 菌液制备 菌株来源于课题组人员筛选出的大肠杆菌多重耐药菌株，即O78、O157，对庆大霉素、四环素、增效磺胺、阿莫西林、链霉素等12种抗菌药物存在耐药性。纯培养后，挑单个菌落于肉汤培养基中培养18 h，采取平板稀释菌落计数法计算菌液含菌量，临用前用灭菌胰蛋白胨大豆肉汤稀释成1×105CFU/mL，冷藏保存。

1.1.2 药液制备 白头翁汤：白头翁60 g、黄柏30 g、黄连45 g、秦皮60 g，采用研究证明最佳工艺提取（吴柯楠等，2020），称取处方量100 g，选取8 倍量60% 乙醇提取3 h，精确量取100 mL 甲醇- 水溶液，配制成浓度为1 g/mL 的溶液，用微孔膜过滤，取滤液冷藏保存。

1.1.3 试验动物 芦花鸡，购自山东金秋农牧科技股份有限公司，300 只，70 日龄，公母各半，平均体重：公鸡约1.3 kg，母鸡约1.1 kg，普通饲料养殖，饲养1 周后确认无大肠杆菌病等异常症状方可用于试验。

1.2 试验方法

1.2.1 测定最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC） 采用微量肉汤棋盘稀释法测定PD 提取液对鸡大肠杆菌的MIC 值，为避免药液颜色和浑浊对结果的影响，将各浓度的培养液接种到普通营养琼脂平板上，37℃培养24 h，观察细菌生长情况来帮助判定。

1.2.2 测定大肠杆菌半数致死量（Median Lethal Dose，LD50） 将50 只鸡随机分为5 组，公母各半，分别经腹腔注射大肠杆菌菌液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，72 h 后统计鸡只死亡情况，以确定引起半数死亡的最佳攻毒剂量。

1.2.3 人工感染试验 将250 只鸡随机分为5组，公母各半，分别为高、中、低计量组、阳性对照组和健康对照组。除健康对照组外，其他组每只鸡腹腔注射最佳攻毒剂量的大肠杆菌菌液0.3 mL。随后观察鸡只症状并检测病原，以确定是否由接种菌感染致死。

1.2.4 药物治疗试验 试验鸡攻毒发病后，对治疗组采用高（0.7 mL/ 只）、中（0.5 mL/ 只）、低（0.3 mL/ 只）3 个剂量进行治疗，1 h 内饮完，每天1 次，连用5 d，停药后观察10 d；同时设阳性对照（感染、不给药）和健康对照（不感染、不给药）组。

1.2.5 治疗效果判定及统计分析 各组药物治疗期间密切关注各组鸡只的发病和恢复情况，其效果判定依据（李连缺等，2019）主要有临床症状观察、剖解病理变化等，判定其属于未治愈、有效和无效。统计出治愈数、有效数和死亡数，并计算其相应的百分比。采用SPSS 21.0 软件进行统计分析，P ＜0.05 表示差异显著。

2 结果及分析

2.1 MIC 值测定结果 PD 对2 株大肠杆菌耐药菌株的MIC 测定结果显示，白头翁汤对1、2 号菌株的MIC 值分别为0.125 g/mL 和0.250 g/mL，对1 号菌株抑菌力较强，平均MIC 值为0.187 g/mL，表明PD 对大肠杆菌有较强的抑菌效果。

2.2 菌株的LD50测定结果 按照1.2.2 的方法测定鸡大肠杆菌的LD50是0.3 mL/ 只，确定为人工感染试验最佳攻毒剂量。

2.3 人工感染试验结果 攻毒7 h 后，鸡只开始出现临床症状，1 d 后逐渐出现死亡。主要表现为食欲减退或废绝、翅膀下垂、拉黄白色稀粪等。剖检可见肝周炎病变，肝脏肿大、充血出血、质地易碎、表面有一层纤维素性渗出物覆盖；心包炎，心包腔中有大量纤维素性渗出物；腹腔脏器黏连，腹膜炎，肠黏膜肿胀、充血、出血，如图1、图2。从病变处均可分离出大肠杆菌，如图3。

图1 心包炎、肝周炎病变

图2 腹膜炎、肠黏膜水肿病变

图3 大肠杆菌（400 倍）

2.4 药物治疗试验结果 高、中、低剂量组的病鸡在用药1 ～2 d 内死亡较多，3 d 后精神开始好转，5 d 后逐渐恢复正常；阳性对照组在实验期间大部分精神不振、少食或不食，陆续死亡，死亡率较高，加之意外死亡，最终死亡率高达51% ；健康对照组由于啄肛死亡1 只，其他一切正常。由表1 可知，中、低剂量组治愈率、死亡率无显著差异（P ＞0.05），但在有效率、无效率上差异显著（P ＜0.05），说明中剂量组有效率高；而高剂量组治愈率达96%、有效率达98%，死亡率控制在2%，明显优于中、低剂量组的治疗效果，且差异显著（P ＜0.05）。阳性对照组与3 种剂量药物治疗组相比存在极显著差异（P ＜0.01）。

表1 PD 对人工感染鸡大肠杆菌病的治疗结果%，μ=50

3 讨论

武怡荷等（2021）、张瀚元（2018）研究表明，复方中药可显著降低鸡大肠杆菌病发病率，提高鸡大肠杆菌病治愈率及总有效率，而且高剂量组复方中药的治疗效果与复方阿莫西林克拉维酸相当，0.5 g/mL 复方中药对鸡大肠杆菌的病疗效最佳，机理是其起抑菌作用的同时增强了鸡红细胞的免疫功能，且该复方中药安全无毒。本试验前期研究发现了PD 和黄连解毒汤对大肠杆菌病均有效，但体内、外抗菌效果不一致，体外抗菌作用直接，效果明显，但体内抗菌机理复杂，药物作用的发挥受机体内环境及其他微生物等因素影响（吕颜枝等，2021）。为了进一步研究PD 的体内外抗菌效果和机理，本试验在测定方剂MIC 值和菌株LD50的基础上进行了体内抗菌机理试验，结果显示，PD 可有效控制鸡大肠杆菌病病死率。但中药方剂组成复杂、成分多、靶点多，作用机理研究较难。付琳等（2021）、刘静茹等（2020）、GUO等（2017）、LING 等（2016）通过现代药理学研究发现，白头翁主要含皂苷类成分，具有抗肿瘤、抗菌消炎、舒张血管等一系列药理活性；黄连主要成分为物碱类、木脂素类、黄酮类等，具有抗肿瘤、降血糖、抗病原微生物、抗炎、改善消化系统等作用；黄柏主要成分是小檗碱、槲皮素、β- 谷甾醇对等，在降血压糖、抗菌、抗癌等方面作用明显；秦皮主要成分为香豆素类、木脂素类、裂环烯醚萜类、黄酮类等，具有抗菌、抗炎、抗氧化、利尿及抗肿瘤作用。PD 作为经典方剂，其药理作用的发挥不是简单的依靠4 味药的化学成分简单相加，而是各成分之间相互作用发挥效应，共奏清热解毒、凉血止痢之功效。

4 结论

本试验结果发现，PD 在鸡大肠杆菌病的治疗上有效率高，尤其是高剂量组抗菌作用最明显，治愈率高达96%，但并不能证明剂量越高治疗效果越好，其机理还需进一步研究。另外，该治愈率是针对人工感染试验鸡只的，属于单一感染，鸡只试验期间没有做相关的疫苗免疫，这些情况均会影响治疗效果，因此，如果在养殖场自然感染的情况下，其治愈率可能会有变化。