河北省部分地区致犊牛腹泻主要病原分布特征

高亚桃，刘智慧，李 妍，刘胜丽，郭姚蕊，马亚宾，蒋桂娥，刘志勇，秦建华*，赵月兰* (.河北农业大学 动物医学院，河北 保定 0700；.河北省畜牧良种工作站， 河北 石家庄 05006； .河北省唐山市动物疫病防控中心，河北 唐山 06400)

犊牛感染性腹泻是奶牛养殖过程中常见的一种临床症状，严重影响犊牛健康，进而影响优质畜产品和乳制品的生产，给养牛业造成巨大的经济损失。犊牛腹泻是由多种原因引起的，主要有感染性腹泻和饮食性腹泻，感染性腹泻是引起犊牛发病和死亡的主要原因，临床上以腹泻、发热等为主要特征，致使犊牛脱水、机体水盐代谢失衡、酸中毒等，严重的可导致死亡[1-2]。感染性腹泻主要包括病毒、细菌和寄生虫性腹泻，病毒主要有牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhoea virus，BVDV)、牛冠状病毒(bovine coronavirus，BCoV)、牛轮状病毒(bovine rotavirus， BRV)、牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)等，细菌主要有大肠杆菌(Escherichiacoli)和沙门菌(Salmonella)等，寄生虫主要有牛隐孢子虫(Cryptosporidiumbovis)和牛球虫(Bovinecoccidia)等[3]。新生犊牛免疫力低下，极易感染多种病原，BVDV、BCoV、BRV、IBRV、牛隐孢子虫、大肠杆菌这几种病原常呈单一感染或混合感染，严重危害犊牛健康。河北省是养殖大省，近年来，在乳制品行业中取得了可观的经济效益，占据重要地位，但是犊牛腹泻已严重阻碍养牛业的发展，良好地培育犊牛健康生长尤为重要，因此，本研究旨在调查河北省内致犊牛腹泻主要病原及分布特征，以期为犊牛腹泻的有效防控提供科学数据支持。

1 材料与方法

1.1 发病情况和被检样品自河北省邢台、衡水、石家庄、沧州、保定、唐山、廊坊和张家口8个地区选取发病牛场，犊牛表现为腹泻、发热、脱水、排稀粥样粪便，部分带血，且表现为呼吸困难、食欲废绝等现象，腹泻率高达50%，病牛腹泻严重、逐渐消瘦，并有部分牛只死亡。在发病牛场中采集犊牛腹泻粪便样品775份，对其进行BVDV、BCoV、BRV、IBRV、隐孢子虫和大肠杆菌6种病原的检测。

1.2 引物设计与合成根据GenBank上登录的BVDV 5′UTR基因、BCoVN基因、BRVVP6基因和IBRVgB基因序列，利用Primer 5.0设计4对特异性引物，并参照文献中隐孢子虫18S rRNA引物[4]和大肠杆菌16S rRNA通用引物[5]序列合成引物，引物均由上海生工生物工程有限公司合成，合成后的引物置于-20℃保存备用，引物序列信息见表1。

表1 本试验所用引物序列

1.3 BVDV、BCoV、BRV、IBRV、大肠杆菌和牛隐孢子虫基因组的提取BVDV、BCoV和BRV 3种病原的鉴定利用RT-PCR方法，IBRV、大肠杆菌和牛隐孢子虫利用PCR方法进行鉴定。

自采集的犊牛腹泻粪便样品中提取BVDV、BCoV、BRV和IBRV基因组，大肠杆菌基因组和隐孢子虫卵囊基因组。病毒基因组的提取方法参照全式金生物科技有限公司EasyPure®Viral DNA/RNA Kit进行操作，大肠杆菌和隐孢子虫卵囊全基因组DNA的提取参照天根生化科技(北京)有限公司的粪便DNA试剂盒进行操作，具体操作步骤按说明书进行。

1.4 BVDV、BCoV、BRV、IBRV、大肠杆菌和牛隐孢子虫基因组的PCR扩增将提取得到的BVDV、BCoV、BRV的RNA反转录合成cDNA，以BVDV、BCoV、BRV的cDNA为模板，分别利用BVDV-F/R、BCoV-F/R和BRV-F/R特异性引物(表1)进行基因片段的PCR扩增。以提取的IBRV、牛隐孢子虫和大肠杆菌 DNA为模板，分别以IBRV-F/R和18S rRNA-F/R特异性引物及16S rRNA-F/R通用引物(表1)进行基因片段的PCR扩增。反应体系均为20 μL，2×Phanta Max Master Mix 10 μL，引物上、下游各1 μL，cDNA/DNA模板各2 μL，ddH2O补足20 μL。将上述加样完成的20 μL试剂吹吸混匀，利用6对引物按照以下PCR反应条件分别进行扩增：预变性95℃ 5 min；变性94℃ 30 s，退火57℃ 30 s(BVDV-F/R、IBRV-F/R)，延伸72℃ 60 s，共35个循环；终延伸72℃ 10 min。预变性95℃ 5 min；变性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s(BCoV-F/R)，延伸72℃ 45 s，共35个循环；终延伸72℃ 10 min。预变性95℃ 5 min；变性94℃ 30 s，退火56℃ 30 s(BRV-F/R)，延伸72℃ 30 s，共35个循环；终延伸72℃ 10 min。预变性95℃ 5 min；变性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s(18S rRNA-F/R、16S rRNA-F/R)，延伸72℃ 60 s，共35个循环；终延伸72℃ 10 min。PCR扩增结束后，取5 μL PCR产物，用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。

2 结果

2.1 BVDV、BCoV、BRV、IBRV、牛隐孢子虫和大肠杆菌PCR检测结果从河北省8个地区多个养殖场采集775份犊牛腹泻样本，经提取病毒核酸，利用各种病毒特异性引物进行PCR检测。结果表明，775份犊牛腹泻临床样品中，有205份样品在189 bp 处出现明亮的特异性条带(图1)，BVDV检测结果为阳性，阳性率为27.11%；有137份在178 bp 处出现明亮的特异性条带(图2)，BCoV检测结果为阳性，阳性率为17.52%；有77份样品在144 bp处出现明亮的特异性条带(图3)，BRV检测结果为阳性，阳性率为9.85%；有29份粪便样品在209 bp处出现明亮的特异性条带(图4)，IBRV检测结果为阳性，阳性率为3.71%；有96份样品在1 188 bp处出现明亮的特异性条带(图5)，隐孢子虫检测结果为阳性，阳性率为12.28%；还有160份粪便样品在1 500 bp处出现明亮的特异性条带(图6)，大肠杆菌检测为阳性，阳性率为20.46%；其中有71份样品未检测出目的病原。从上述检测结果可见，在河北省部分地区采集的奶牛腹泻粪便中，BVDV检测阳性率最高为27.11%，是河北省部分奶牛场致犊牛腹泻的主要病原之一，且唐山和张家口2个地区奶牛场BVDV感染率高于其他6个地区(表2)。

M.DL2000 DNA Marker；1～2.被检样品；3.阴性对照图1 BVDV PCR检测结果

M.DL2000 DNA Marker；1～2.被检样品；3.阴性对照图2 BCoV PCR检测结果

M. DL2000 DNA Marker；1～2.被检样品；3.阴性对照图3 BRV PCR检测结果

M. DL2000 DNA Marker；1～5.被检样品；6.阴性对照图4 IBRV PCR检测结果

M. DL2000 DNA Marker；1～2.被检样品；3.阴性对照图5 大肠杆菌 PCR检测结果

M. DL2000 DNA Marker；1～2.被检样品；3.阴性对照图6 隐孢子虫PCR检测结果

表2 河北省部分地区致犊牛腹泻主要病原PCR检测结果 份

2.2 多重病原检测结果在775份样品中，选取临床症状严重且病程较长的117份样品进行多种病原检测，结果表明，6种病原之间存在二重、三重和四重感染(表3～5)。

表3 二重病原感染情况

表4 三重病原感染情况

表5 四重病原感染情况

2.3 不同采样季节与BVDV感染情况结果从2019年1月到2021年1月对从河北省不同地区采集的奶牛粪便进行PCR检测。检测结果表明，春季BVDV的检出率为9.93%，夏季BVDV检出率为6.92%，秋季BVDV的检出率为31.92%，冬季BVDV检出率为40.21%，在秋冬季节BVDV的检出率较高，高于春季和夏季，尤其是冬季检出率最高，春夏两季BVDV的感染率没有明显差异(表6，图7)。

图7 不同季节奶牛BVDV检测结果

表6 不同季节奶牛BVDV检测结果

2.4 不同采样地点与BVDV感染情况结果从河北省8个地区采集的775份奶牛粪便样品，经过PCR检测，结果表明，不同地区BVDV的感染率存在明显差异，其中，唐山奶牛场BVDV感染率最高为39.17%，张家口次之,感染率为38.16%，衡水感染率最低为8.05%，其他5个地区邢台、石家庄、沧州、保定、廊坊奶牛场BVDV的感染率分别为13.24%,11.46%，23.81%，29.23%和19.57%(表7，图8)。

表7 不同地区奶牛BVDV检测结果

3 讨论

犊牛感染性腹泻病是由多种病原引起的严重危害犊牛健康的接触性传染病[6]，致犊牛腹泻的病原主要包括病毒、细菌和寄生虫，严重影响犊牛的生长发育，对养牛业造成巨大的经济损失[7]。引起犊牛腹泻的病毒主要有BVDV、BCoV、BRV和IBRV等[8]。BVDV属于黄病毒科瘟病毒属，是单股正链RNA病毒，感染该病毒的牛主要表现为腹泻、黏膜发绀、消化道黏膜糜烂、免疫耐受和持续性感染等[2]，危害严重，呈世界范围分布。BCoV属于冠状病毒科冠状病毒属，为不分段的单股正链RNA病毒，是引起犊牛腹泻和呼吸道感染的重要病原[9]，感染BCoV的犊牛主要表现为腹泻，也可导致成年牛冬痢，呼吸道感染引起牛肺炎等[10]。BRV属于呼肠孤病毒科，轮状病毒属，是引起犊牛腹泻的主要病原之一，患病牛以排水样稀粪为主要特征，多可引起继发感染，且该病原呈世界性分布[11]。IBRV可引起牛一种急性、热性、接触性传染病，该病毒是双股DNA病毒[12]，感染该病毒的牛主要表现为呼吸道症状，也是引起牛肠炎型腹泻的重要病原之一，患病牛有时可出现带血性腹泻，新生犊牛可表现为腹泻呈水样、脱水、精神萎靡、机体衰竭等[13]。致病性大肠杆菌(Escherichiacoli)是引起犊牛腹泻、脱水、酸中毒等为主要特征的一种急性传染病[14]，大肠杆菌病在各个国家都有发生，10日龄以内的犊牛最为易感，也是导致1月龄左右犊牛死亡的主要原因之一。引起犊牛腹泻的寄生虫主要是隐孢子虫，隐孢子虫属于隐孢子科(Cryptosporididae)、隐孢子属(Cryptosporidium)寄生性原虫，是引起腹泻的3种最普通的肠道病原之一[15]。隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是由隐孢子虫寄生于人类和动物呼吸道或消化道上皮细胞，引起以腹泻为主要临床症状的肠道原虫病[16]。隐孢子虫可感染多种脊椎动物和人类，最易感的是幼龄动物，是新生犊牛腹泻的主要病原之一[17]。牛最易感的隐孢子虫类型主要包括微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫、牛隐孢子虫、瑞氏隐孢子虫等4种[18]。隐孢子虫对外界环境抵抗力强，能够在潮湿、阴冷的环境中存活约6个月，当易感动物接触到有活性的卵囊时，很容易被感染。奶牛是隐孢子虫自然感染的主要动物之一，研究者就隐孢子虫导致犊牛腹泻这一问题进行了很多研究，但卵囊的寄生路径、脱囊后所寄生的位置和作用机制等问题还未完全掌握，有待进一步研究。犊牛腹泻病已严重损害犊牛健康，无论在国内还是国外都造成巨大的经济损失[19]，因此，研究引起犊牛腹泻的主要病原具有重要意义。

本研究对从河北省8个地区采集的775份粪便进行检测，根据BVDV 5′UTR基因、BCoVN端基因、BRVVP6基因和IBRVgB基因分别设计特异性引物，对这4种病毒进行PCR检测，同时参照文献中隐孢子虫特异性引物和大肠杆菌通用引物对隐孢子虫和大肠杆菌进行PCR检测。其中BVDV检出205份阳性，BCoV检出137份阳性，BRV检出77份阳性，IBRV检出29份阳性，隐孢子虫检出96份阳性，大肠杆菌检出160份阳性，另外还有71份粪便样品未检出病原。就BVDV检测阳性率高低地区进行分析，唐山和张家口2个地区奶牛场BVDV感染率明显高于其他6个地区，由于张家口地区位于河北省北部，冬季环境寒冷，犊牛在寒冷的环境极易引起腹泻，容易继发感染其他病原，所以环境寒冷应该是张家口地区BVDV阳性率高的原因之一；唐山地区地处河北省东北部，该地区水源丰富，空气湿润，犊牛经常处于潮湿环境下会造成抵抗力下降，饮食不佳，继而较容易引起疾病，腹泻就是一种较常见的疾病。因此当地奶牛场应该给予重视，加强饲养管理，做好预防工作。经调查，秋、冬季节BVDV的检出率较高，明显高于春季和夏季，尤其是冬季检出率最高，因此在秋、冬季节，牛场要注意给牛群做好保暖，及时清除污粪，勤换垫草垫料等，为犊牛的生长提供舒适的环境。本研究对河北省8个地区采集的犊牛腹泻粪便样品经过检测，结果发现，BVDV的检出率最高，为27.11%，表明BVDV是河北省部分地区致犊牛腹泻的主要病原，这一研究为河北省内致犊牛腹泻病原的调查提供科学数据支持，为犊牛腹泻病的防制提供方向，对河北省内BVDV的防控具有重要意义。

对检出病原的犊牛应针对病情给予治疗，另外，要加强饲养管理，为犊牛生长发育提供适宜的环境；对于71份粪便样品未检出病原这一结果进行分析，原因有以下几个方面：第一，被检的牛只出现的腹泻，不是这几种病原引起的，引起犊牛腹泻的病原有很多，除本研究着重检测的6种病原外，还有BPV、诺如病毒(bovine Norovirus，BNoV)、牛球虫等多种病原[20-22]，对导致犊牛腹泻的其他病原应引起重视，防制结合，为犊牛生长提供良好的大环境；第二，由于粪便样品中病原含量少，没有达到普通PCR能检出的最低限。因此，针对致犊牛腹泻病原建立敏感性较高的检测方法具有重要意义，为临床上研究犊牛腹泻病原提供一种快速、有效的手段迫在眉睫。