江西地区腹泻仔猪肠道致病菌谱的分析及梭杆菌的分离鉴定

吴允正，陶天宇，张庆生，戴益民，曾 秀，张 玲，王 娇，张锦华* (.江西农业大学 动物科学技术学院，江西 南昌 330045；.江西省吉安市畜牧兽医局，江西 吉安 343000)

腹泻是仔猪常见的疾病之一，能降低仔猪日增重和饲料转化率，造成仔猪生长缓慢、死亡率上升，是损害仔猪生长性能的主要因素。研究表明，几乎有一半的仔猪死亡是感染性腹泻引起的[1]。仔猪出生后1周内，容易发生腹泻，除感染流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒等病毒性腹泻外，仔猪细菌性腹泻是重要病因，仔猪肠道微生态平衡失调导致条件致病菌大量增加[2]。仔猪的胃肠道内存在多种共生微生物，这些微生物大多是有益的，能提供必要的营养或阻挡病原微生物的入侵和定植，在肠道生态系统形成天然屏障，如果这种天然屏障未完全形成，或被破坏，肠道的致病共栖菌(pathobionts)就会在肠道内富集，引起肠道菌群紊乱，导致宿主肠道疾病的发生[3-4]。研究表明，当肠道内大肠杆菌、产气荚膜梭菌、梭杆菌等有害菌丰度增加，可能引发急性坏死性小肠结肠炎(NEC)等腹泻症状[5-7]。仔猪肠道菌群组成复杂、干扰因素众多，相比于菌群结构较为相似的健康个体，失调个体间菌群差异更大，符合“安娜·卡列尼娜原则”[8-9]。因此，从微生态学的角度分析，造成仔猪腹泻不是单一的病原菌，而是一些与宿主共生细菌在微生态失调时大量增殖，直接参与疾病的发展，这些细菌称为致病共栖菌谱[10]。

梭杆菌在人类及动物肠道中普遍存在，尤其是具核梭杆菌，大量研究表明，具核梭杆菌能从各种临床标本中被分离出来，并且发现其在病变组织中的分布高于正常组织,已被证实为一种条件致病菌[11-12]。梭杆菌可促进不能直接黏附或入侵的肠道病原菌的定植，能导致肠道屏障受损[13]。近年来，国内外许多研究都集中在具核梭杆菌与结直肠癌发病机制关系，以粪便样品中具核梭杆菌作为生物标志物，用于结直肠癌无创检测[14-16]。然而，梭杆菌与仔猪腹泻等疾病之间的相关性鲜有报道。本课题组前期对江西地区新生仔猪肠道菌群研究发现：梭杆菌在腹泻新生仔猪肠道丰度明显高于健康仔猪，与新生仔猪腹泻呈正相关。

本研究通过细菌16S rDNA V3～V4区高通量测序、荧光定量PCR和PCR-DGGE等分子生物学技术比较分析腹泻仔猪和健康仔猪肠道菌群组成差异，并对腹泻仔猪肠道致病菌进行分离鉴定，旨在揭示腹泻仔猪的肠道致病菌谱，探索腹泻仔猪的检测指示菌。

1 材料与方法

1.1 样品来源及采集选取江西省7个不同地区同一窝内有健康和腹泻仔猪的猪场，采集7日龄内仔猪粪样48份(腹泻和健康样品各24份)，分别标记为健康组(H组，n=24)和腹泻组(D组，n=24) ，样品分组情况见表1。同一地区的样品均来源于同一头母猪哺乳期内仔猪新鲜粪便；腹泻仔猪排稀粪，出现精神不振、脱水等症状，24份腹泻仔猪样品经检测，猪流行性腹泻病毒、猪传染性肠胃炎病毒均为阴性。将样品低温送至实验室，用于细菌的分离；并提取总细菌DNA分析肠道菌群结构。

表1 样品来源及分组情况 份

1.2 培养基及主要试剂哥伦比亚培养基购自青岛海博生物技术有限公司；革兰染色液、细菌基因组DNA快速抽提试剂盒、粪便细菌总DNA快速抽提试剂盒等购自上海生工生物工程有限公司。

1.3 DNA提取与测序各取仔猪粪便样品100～200 mg，采用DNA快速抽提试剂盒对粪便细菌总DNA进行提取。所提取的DNA于-20℃保存，干冰条件下送往上海美吉生物科技有限公司，对样品进行PCR扩增及测序。将各样本序列进行质量控制过滤后，进行Alpha多样性及菌群组成分析。

1.4 荧光定量PCR测定仔猪粪样中的梭杆菌数参照文献[17]设计梭杆菌特异性引物(F:5′-CAACCATTACTTTAACTCTACCATGTTCA-3′；R:5′-TACTGAGGGAGATTATGTAAAAATC-3′)，对梭杆菌基因进行扩增。将 PCR扩增产物回收纯化后进行测序，按试剂盒说明书提取质粒。将质粒进行10倍系列梯度稀释(108～104拷贝)，以梯度稀释质粒为模板进行q-PCR检测并绘制标准曲线[18]。将江西南昌地区的8份仔猪粪便样品总DNA稀释至100 mg/L。反应体系：SyBr Green 5.0 μL，Rox 0.5 μL，上、下游引物各0.1 μL，ddH2O 3.3 μL，模板1.0 μL，引物终浓度为 0.1 mmol/L。反应程序:95℃预变性90 s；95℃变性10 s，57℃退火30 s，共40个循环；溶解曲线温度为60～95℃[19]。

1.5 数据统计分析数据采用SPSS 21.0软件中双尾t检验进行统计学分析，P<0.05为显著水平，P<0.01为极显著水平。

1.6 梭杆菌PCR-DGGE分析使用梭杆菌属引物[20](Fus F:5′-GGATTTATTGGGCGTAAAG-3′;Fus R:5′-GGCATTCCTACAAATATCTACG-3′)，在Fus F的5′ 端加入一个40 bp的GC夹子(CCGCCCGCCGCGGCGGCGGGCGGGGCGGGG-GCACGGGGGG)，对南昌地区仔猪粪便样品细菌总DNA进行PCR扩增；PCR产物进行DGGE分析，胶浓度梯度为35%～65%，电压设置120 V电泳8 h[21]。对达到测序要求的条带进行切胶并回收，以胶回收产物为模板，用梭杆菌属引物进行PCR,产物送至上海生工测序。

1.7 梭杆菌的分离鉴定将南昌等7个地区腹泻仔猪粪便样品加入适量生理盐水充分混匀后，分别涂布于含有100 mg/L新霉素，5 mg/L万古霉素和1 mg/L红霉素的哥伦比亚血琼脂培养基上，37℃厌氧培养72 h后观察菌株生长情况[22]，根据形态(形状、颜色、表面、边缘、突起) 不同的菌落划线培养3次，直至纯化为单一菌落，利用革兰染色镜检对分离菌株做初步鉴定。采用试剂盒提取分离菌株的DNA，并进行PCR扩增，所用引物为27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1 492R:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′。扩增条件:95℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸1.5 min，共30个循环。将PCR扩增产物回收纯化后进行测序。将测序结果通过BLAST进行比对，选择同源性较高的菌株序列进行同源性分析，使用MegAlign构建系统发育树。

2 结果

2.1 高通量测序分析

2.1.1腹泻及健康仔猪肠道菌群的组成 为了解腹泻仔猪肠道的细菌群落组成，对腹泻与健康仔猪肠道细菌16S rDNA基因V3～V4进行了序列分析。通过测序质控筛选后，选择97%相似度的OTU，对仔猪肠道菌群组成进行分析。结果显示，H与D组样本共有716个OTU，H组特有181个OTU，D组特有139个OTU，H组OTU数量高于D组(图1A)，表明H组较D组微生物组成更具多样性。7个地区腹泻仔猪肠道菌群共有的OTU有56个，不同地区样品特有的OTU数差异较大，其中南昌地区样品中特有的OTU数最多，达259个(图1B)。

本试验共测得20个细菌门分类物种,其中共有16个细菌门，仅在H组中检测出的有2个，分别是脱铁杆菌门(Deferribacteres)、迷踪菌门(Elusimicrobia)，仅在D组中检测出的也有2个，分别是绿菌门(Chlorobi)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)(图2A)。健康仔猪和腹泻仔猪肠道微生物均以厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteria)为主要优势菌群。但H组中厚壁菌门所占比例较D组高,而D组的梭杆菌门占比较高，其相对丰度分布见图2B。7个地区腹泻仔猪肠道菌群共有的门类有6个，上饶、南昌地区分别特有门类为4和1个，其他地区无特有的门类(图2C)。

在属水平上，从Venn图(图 3A) 中可以看出,2组共检测出324种菌属,其中270种菌属重叠，只在H组中检测出的菌属有34种，只在D组中检测出的菌属有20种，其相对丰度分布见图3B。其中Escherichia、Shigella、拟杆菌属(Bacteroides)为H组中相对丰度最高的优势菌属，次要优势菌属均低于10%,包括:梭杆菌属(Fusobacterium)、乳酸菌属(Lactobacillus) 等;而D组相对丰度最高的菌属为梭杆菌属、拟杆菌属、Escherichia、Shigella，次要优势菌属包括：放线菌属、RuminococcaceaeUCG-002菌属、巴斯德菌属(Pasteurella)、乳酸菌属等；各地区腹泻仔猪肠道菌群共有的属有51个，南昌地区特有的属最多，达46个(图3C)。

图3 各组样品在属水平上的Venn图(A)和相对丰度(B)及7个地区D组属水平Venn图(C)

2.1.2腹泻和健康仔猪肠道菌群组成的差异分析 通过2组样品物种差异分析，发现腹泻仔猪肠道与健康仔猪肠道具有显著性差异的微生物类群：在属水平上(图4A)，D组中乳酸菌属相对丰度显著低于H组(P< 0.05),Escherichia、Shigella、拟杆菌属相对丰度低于H组，但差异不显著(P>0.05);在种水平上(图4B)，D组中unclassifiedLactobacillus相对丰度极显著低于H组(P<0.01)，食淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)相对丰度显著低于H组，而死亡梭杆菌(Fusobacteriummortiferum)相对丰度显著高于H组(P< 0.05)。

图4 各组样品在属水平(A)和种水平(B)物种差异分析(丰度前15的物种)

通过LEfSe多级物种差异判别分析得出，H组乳酸菌属的食淀粉乳杆菌、unclassifiedLactobacillus等是使组间菌群结构发生显著性差异的主要贡献菌，而D组梭杆菌属中的死亡梭杆菌是引起组间菌群结构发生变化的主要菌群(图5)。

图5 仔猪肠道菌群LEfSe属水平上物种差异判别分析(LDA>2)

2.2 荧光定量PCR检测仔猪肠道中梭杆菌对含梭杆菌属特异基因片段重组质粒进行10倍系列梯度稀释，得到104～108拷贝/μL的标准品，显示扩增结果较好。以质粒拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标作标准曲线，R2值为0.987，这表明Ct值与标准质粒拷贝数的对数之间存在较好的线性关系，作为梭杆菌属计数的标准品符合计数要求(图6A)。荧光定量PCR分析结果显示，南昌地区腹泻仔猪粪便样品DNA中检测到的梭杆菌数量显著高于健康仔猪(P<0.05，图6B)，与16S rDNA高通量测序结果一致。

图6 荧光定量PCR标准曲线(A)和仔猪粪便样品中梭杆菌数量(B)

2.3 DGGE图谱条带的DNA序列分析对梭杆菌属DGGE指纹图谱中主要的条带进行测序分析，将测序结果在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)上用BLAST进行序列同源性比对。结果显示，腹泻及健康仔猪样品泳道A1～A8的DNA条带测序结果与Fusobacteriumnucleatum(登录号：GU412343.1)同源性最高；在腹泻仔猪样品中还检测到其他2种梭杆菌，分别是B3泳道的Fusobacteriumgastrosuis(登录号：NR146837.2)，对比区分度为99.19%；C1～C4泳道的unculturedFusobacteriumsp.(登录号：MN215159.1)为腹泻组样品共有检测到的梭杆菌，对比区分度为96.97%(图7)。

1～4.腹泻组样品；5～8.健康样品；9.阴性对照;A～C.各电泳条带纵列位置图7 梭杆菌属DGGE指纹图谱

2.4 梭杆菌的分离鉴定从南昌和九江地区的腹泻样品中各分离到1株梭杆菌，该菌在哥伦比亚血琼脂培养基上长出圆形凸状菌落，中心不透明，边缘呈半透明，无溶血。革兰染色阴性，其中1株菌体细长、两端尖细如梭状，编号为FB1，如图8A所示；另1株菌体形态具有多形性，有部分菌体呈梭状，两端尖细，有部分游离者为椭圆体(圆体肿胀区)，菌体中有革兰阳性颗粒存在，编号为GH1，如图8B所示。

图8 菌株FB1(A)和GH1(B)革兰染色镜检 (×1 000)

根据菌落形状大小、革兰染色镜检特性，并结合16S rDNA鉴定，确定得到的纯化菌株鉴定结果为具核梭杆菌和死亡梭杆菌。将分离菌株16S rRNA基因测序结果在NCBI上用BLAST进行序列同源性比对后，选取同源性较高的序列，利用MegAlign软件进行序列分析后建立遗传基因系统进化树，结果如图9所示：分离菌株FB1、GH1分别与具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)和死亡梭杆菌(Fusobacteriummortiferum)同源性在99.2%～99.4% 之间，同源性较高；分离菌株FB1与Fusobacteriumnucleatum、Fusobacteriumnucleatumsubsp.属于同一分支，而分离菌株GH1与Fusobacteriummortiferum、Clostridiumrectum属于同一分支。

图9 基于16S rDNA基因构建的系统发育树

3 讨论

动物肠道微生态菌群平衡失调可能会导致仔猪生理功能紊乱，引起肠道疾病的发生，而粪便菌群变化可一定程度反映肠道菌群的状态[23]。SEKIROV等[24]和LIU等[25]发现，当肠道微生物菌群结构发生改变时会导致宿主患病。大肠埃希菌首先作为一种肠道致病共栖菌谱(pathobionts)被研究者提出[26]。本研究通过高通量测序技术、荧光定量PCR，并结合PCR-DGGE指纹图谱技术对仔猪肠道菌群进行分析，腹泻仔猪与健康仔猪肠道菌群相比，主要体现在梭杆菌属丰度增高和乳酸杆菌属丰度降低，提示梭杆菌可能是引起仔猪腹泻的致病共栖菌谱中的重要成员。

梭杆菌被认为是一种炎症微生物，是抑制T细胞反应和促进炎症因子表达的预后生物标志物[27-28]。HUH等[29]研究发现，IBD患者及结直肠癌患者的粪便样品中具核梭杆菌含量显著高于健康人群。LIU等[30]通过对诱导患结肠炎小鼠及正常小鼠粪便细菌含量进行检测，结果发现患病小鼠粪便中具核梭杆菌的丰度显著高于正常小鼠。THE等[31]研究表明，在腹泻患者人群粪便中死亡梭杆菌丰度也显著升高。COSTA等[32]的研究表明，腹泻仔猪和患有结肠炎马的粪便中梭杆菌的相对丰度显著增加。本试验腹泻组仔猪肠道中梭杆菌门的丰度高达16.58%，相比于健康组(8.85%)升高将近一倍，这与HERMANN-BANK等[33]的研究结果类似。荧光定量PCR试验也进一步验证了梭杆菌数的菌群分析结果，从而推测梭杆菌丰度升高可能是造成仔猪腹泻的微生态病因。

PCR-DGGE技术在一定程度上可对第2代细菌16S rDNA高通量测序在种水平上进行补充。本试验结果显示，相比于H组，D组中的死亡梭杆菌显著升高。经LEfSe分析发现，死亡梭杆菌在腹泻组的判别得分最高，这说明腹泻仔猪肠道中死亡梭杆菌对肠道菌群结构起到了重要影响，这与HAN等[7]报道相一致，其或许是引起仔猪腹泻的关键菌。有研究表明，死亡梭杆菌可以分泌一种细菌素，能够对乳酸菌的生长产生抑制作用[34]。从梭杆菌属的DGGE图谱可得知，腹泻样品组中梭杆菌DNA条带的数量多于健康组，且整体条带亮度高于健康组，说明腹泻仔猪的梭杆菌种类及丰度高于健康仔猪；梭杆菌是一种较为严格的厌氧菌，24份腹泻样品最后只分离纯化得到2株梭杆菌，其培养技术还需进一步完善。本研究利用PCR-DGGE分子技术在腹泻仔猪样品中检测到的unculturedFusobacteriumsp.(登录号：MN215159.1)与传统分离培养技术得到的死亡梭杆菌是否为同种细菌还需进一步研究。

本试验结果显示：腹泻仔猪与健康仔猪肠道菌群差异较大，腹泻仔猪肠道中梭杆菌数量显著高于健康仔猪(P<0.05)，主要体现肠道中死亡梭杆菌等相对丰度的增加及有益菌食淀粉乳杆菌、unclassifiedLactobacillus等相对丰度的减少，推测梭杆菌与仔猪腹泻密切相关，死亡梭杆菌可作为仔猪腹泻致病共栖菌谱的重要成员，但分离到的死亡梭杆菌、具核梭杆菌与仔猪腹泻的关系还需进一步研究。本试验的研究结果为诊断及预防仔猪肠道疾病提供新思路。