新型黄酒发酵工艺条件优化

黄 河，黄 婷，王 媚，李 征，赵金松，，3*

（1.四川省酒业集团科技开发有限公司，四川 成都 610199；2.四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾 643002；3.四川省酒业集团有限责任公司，四川 泸州 611230）

黄酒起源于中国，享有“酒中之祖”、“酒中之王”、“中国酒中的瑰宝”美誉[1-2]，与葡萄酒、啤酒被称为世界上三大古酒[3-4]。黄酒的特色是“以麦制曲，以曲酿酒”[5]，麦曲在黄酒酿造过程中至关重要，可作为黄酒酿造的糖化剂、发酵剂和生香剂，被称为“酒之骨”[6-7]，黄酒的高浓液态发酵技术、双边并行复式发酵技术均经过多种微生物共同发酵的过程，特定的发酵工艺使黄酒具有独特的风味特征以及特定的功能性[8]。因此，黄酒酒体醇和、酒香突出[9]，营养丰富[10]，且富含丰富的功能因子[11]，如活性多糖、功能性低聚糖、黄酮类、酚类、萜烯类、三羟甲基丙烷、γ-氨基丁酸、谷胱甘肽等，具有抗氧化、提高机体免疫力、预防心血管疾病等多种生理功能[12-16]，深受消费者喜爱。但近年来，黄酒发展速度一直比较缓慢，因此，为黄酒行业的发展寻找新的突破口迫在眉睫。在传统黄酒酿造的基础上，开发新型黄酒是一种有效方式。目前，对于新型黄酒的定义尚不明确，主要指的是通过工艺创新制得的黄酒，其酒质、风味与传统黄酒有所区别，符合消费者需求以及新饮酒观[17]。

日本清酒的酿造工艺受中国“曲糵酿酒”的影响。在清酒酿造中，发挥主要作用的是属于酿酒酵母类的清酒酵母。日本清酒酵母具有发酵性能好、代谢产物富含果香、发酵酒体口感清爽、在发酵过程中不会形成高泡、罐利用系数较高等优点[18]。日本清酒和中国黄酒是同一类型的低度酿造米酒，两者的功能因子和保健功能相似，但风格上有很大的差异。日本清酒品种繁多，清澈透明，色泽淡黄或无色，酸度小，酒度低，口味棉柔爽口，酸甜苦辣涩味协调，适饮性高，是日本国内餐桌常见的饮料，并远销国外[19]。市场影响力不及清酒，日本清酒在中国市场占有率不断增加。中国黄酒与日本清酒的酿造工艺相仿，故清酒的先进生产技术对我国黄酒有一定的借鉴意义。因此，开发一种具有清酒特色的新型黄酒，丰富中国酒类饮料市场已迫在眉睫[20]。目前，还没有关于采用日本清酒酵母酿造黄酒的研究报道。

该研究采用日本清酒酵母，结合日本清酒的三段投料方法，利用传统黄酒高浓液态发酵特点制备新型黄酒。以总加权评分值为评价指标，通过单因素试验与响应面试验优化新型黄酒的发酵工艺条件，并对新型黄酒的品质进行评价。以期开发独具特色、受众广泛的新型黄酒，为满足黄酒的多元化及市场化的发展需求提供基础支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料与菌株

粳米、小麦：采购自沃尔玛超市；米曲霉（Aspergillus oryzae）Su-16和AOK139、日本清酒酵母（Iaponica propter fermentum）ACCC20045：西南工业微生物菌种保藏中心。

1.1.2 试剂

乳酸（食品级）：成都科龙化工有限公司；甲醛溶液（36%～38%）、亚铁氰化钾：成都市科龙化工试剂厂；氢氧化钠：成都金山化学试剂有限公司；无水葡萄糖、无水乙醇：成都市科隆化学品有限公司；重铬酸钾：重庆川东化工（集团）有限公司化学试剂厂；酒石酸钾钠：西陇化工股份有限公司。所用试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Phs-25酸度计：成都世纪方舟科技有限公司；CP213电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；BT457电子天平：深圳市博途电子科技有限公司；101-3SB电热恒温干燥箱：绍兴市苏珀仪器有限公司；HH-S恒温水浴锅：江苏省金坛市正基仪器有限公司；UV1000紫外可见分光光度计：北京莱伯泰科科技有限公司；TM05C实验用碾米机：佐竹机械（苏州）有限公司；LRH-250A生化培养箱：泰宏医疗器械有限公司；0.45 μm不锈钢正压桶式过滤器：上海羽令过滤器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 新型黄酒生产工艺流程及操作要点

（1）生产工艺流程[18，21]

（2）操作要点[21-22]：

粳米预处理：选取粳米，采用实验用碾米机将其打磨至精米率80%后浸泡24～36 h，洗涤滤干。

蒸饭：称100 g浸泡后的粳米至250 mL三角瓶，密封、圆汽后，于高压灭菌锅内110 ℃蒸45 min。冷却，移至1 000 mL烧杯中。

米麦曲的制备：选取原料总质量70%的粳米，按上述方法进行预处理、蒸饭后获得熟米饭，与30%的小麦混合后，接种Su-16和AOK139孢子（原料量的0.5%），获得米麦曲。

糖化：在熟米饭中加入称量好的米麦曲（原料粳米用量的12%～14%）、适量蒸馏水（米和水的比例在1∶2以上），混合均匀，密封，于56 ℃糖化5 h；加入水分与大米总质量7‰的乳酸，继续于56 ℃糖化1 h，急速冷却到室温。

发酵：于上述物料中加入0.1%原料的日本清酒酵母，于30 ℃发酵1 d。大米原料基本上已被利用发酵，获得人工酵母培养液（酒母）。

糖化、发酵：按照上述方法蒸饭，分三次加入原料粳米、米麦曲、蒸馏水（请分别补充这三者比例）。第一次投料用量为制作酒母原料用量的2倍，18 ℃糖化发酵2 d；第二次投料用量为第一次投料用量的2倍，12 ℃糖化发酵1 d；第三次投料用量为第二次投料用量的2倍，主发酵温度（15 ℃）糖化发酵20 d。三段投料且喂饭量逐步增大，有利于扩大投料量，促进醪液翻耙，产酒量最大。

压滤：无纺布精密细沙滤网食用绢布袋，手动压滤。

沉降、过滤：4 ℃条件下沉降1昼夜，然后取上清液，0.45 μm不锈钢正压桶式过滤器过滤。

煎酒：于85 ℃加热25 min，100 ℃水浴灭菌30 min。

陈酿：分别于4 ℃和25～33 ℃温度下间隔10 d交替陈酿，共计2个月，即得新型黄酒。

1.3.2 新型黄酒发酵工艺优化

单因素试验：以米麦曲添加量（10%、20%、30%、40%、50%）；日本清酒酵母添加量（1%、2%、3%、4%、5%）；主发酵温度（12 ℃、13 ℃、14 ℃、15 ℃、16 ℃）；料水比（原料粳米与水的质量比）（1.0∶0.8、1.0∶1.0、1.0∶1.2、1.0∶1.4、1.0∶1.6（g∶mL））为影响因素进行单因素试验，以感官评分、酒精度、非糖固形物含量及氨基酸态氮含量为评价指标，考察各因素对新型黄酒品质的影响。

响应面试验：固定日本清酒酵母添加量为3%，在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken试验设计对米麦曲添加量（A）、主发酵温度（B）、料水比（C）三个主要影响因素进行优化，以总加权评分（总加权评分值的构成为：感官评分30%、氨基酸态氮含量30%、酒精度20%、非糖固形物含量20%）为响应值（Y），采用Design Expert 8.0.6软件设计3因素3水平的响应面试验，因素及水平见表1。

表1 新型黄酒发酵工艺优化Box-Behnken试验因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-behnken experiments for fermentation process optimization of new-type Huangjiu

1.3.3 分析检测

pH值的测定：参照GB/T 13662—2018《黄酒》[23]中的6.4电位滴定法；氨基酸态氮含量的测定：参照GB/T 13662—2018《黄酒》[23]中的6.5电位滴定法；总糖含量的测定：参照GB/T 13662—2018《黄酒》[23]中的6.2.2亚铁氰化钾滴定法（仲裁法）；非糖固形物含量的测定：参照GB/T 13662—2018《黄酒》[23]中6.3.1重量法（仲裁法）；酒精度的测定：重铬酸钾氧化比色法[24]。

1.3.4 感官评价

按照GB/T 13662—2018《黄酒》[25]中传统型半干黄酒感官评价方法，结合日本清酒感官评价标准[20]，制定的新型黄酒的感官评价标准见表2，满分为100分，选7名酒类品评专业人员，通过感官品评对新型黄酒的各项进行评分，结果取平均值。

表2 新型黄酒感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standards of new-type Huangjiu

1.3.5 统计分析

采用Design-Expert 8.0.6软件，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原则进行响应面试验，并利用SPSS 22.0统计软件对试验结果进行多重比较。采用Origin 2021软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 新型黄酒发酵工艺优化单因素试验结果

2.1.1 米麦曲添加量的确定

米麦曲添加量对新型黄酒感官评分和理化指标的影响见图1。

图1 米麦曲添加量对新型黄酒感官评分和理化指标的影响Fig.1 Effects of Mimaiqu addition on sensory scores and physicochemical indexes of new-type Huangjiu

由图1可知，随着米麦曲添加量在10%～50%范围内的增加，新型黄酒中氨基酸态氮含量逐渐上升；在米麦曲添加量50%时，氨基酸态氮含量达到最大值，为0.70 g/L。而非糖固形物含量呈下降趋势，当米麦曲添加量为10%时，新型黄酒非糖固形物含量最高，为27.2 g/L。当米麦曲添加量在10%～30%之间时，酒精度逐渐增加；米麦曲添加量为30%时，酒精度达到最高，为15.5%vol；米麦曲添加量＞30%，酒精度有所下降，但米麦曲添加量在20%～30%范围内时，酒精度变化不显著（P＞0.05）。随着米麦曲添加量在10%～20%范围内的增加，新型黄酒感官评分逐渐上升；在米麦曲添加量为20%时，感官评分达到最高值，为95分；随着米麦曲霉添加量继续增加，感官评分逐渐下降。综合考虑，选择最佳米麦曲添加量为20%。

2.1.2 酵母添加量的确定

酵母添加量对新型黄酒感官评分和理化指标的影响见图2。

图2 酵母添加量对新型黄酒感官评分和理化指标的影响Fig.2 Effect of yeast addition on sensory scores and physicochemical indexes of new-type Huangjiu

由图2可知，随着酵母添加量在1%～5%范围内的增加，新型黄酒的氨基酸态氮含量呈缓慢增加的趋势，但氨基酸态氮含量差异不显著（P＞0.05）。酵母添加量＜4%时，非糖固形物含量缓慢上升；当酵母添加量为4%时，非糖固形物含量达到最高值，为27.2 g/L；酵母添加量＞4%时，非糖固形物含量有所下降，但差异不显著（P＞0.05）；酵母添加量在1%～3%范围内时，酒精度缓慢上升；当酵母添加量为3%时，酒精度达到15.0%vol，酵母添加量＞3%，酒精度值有所下降，但差异不显著（P＞0.05）。酵母添加量1%～3%范围内，感官评分逐渐增加；当酵母添加量为3%时，感官评分达到最高值，为80分；酵母添加量＞3%，感官评分下降（P＞0.05）。综合考虑，选择最佳酵母添加量为3%。

2.1.3 主发酵温度的确定

温度是影响酶活性的主要因素，温度偏低，酶的活性受到抑制，发酵不充分，酒精度会偏低[25]。主发酵温度对新型黄酒感官评分和理化指标的影响见图3。

图3 主发酵温度对新型黄酒感官评分和理化指标的影响Fig.3 Effect of main fermentation temperature on sensory scores and physicochemical indexes of new-type Huangjiu

由图3可知，随着主发酵温度在12～16 ℃范围内的增加，氨基酸态氮含量缓慢增加，当主发酵温度为16 ℃时，氨基酸态氮含量达到最大值，为0.56 g/L。主发酵温度在12～15 ℃范围内时，非糖固形物含量逐渐增加；主发酵温度为15 ℃时，达到最高值，为26.3 g/L；主发酵温度高于15 ℃，非糖固形物含量开始下降。随着主发酵温度升高，新型黄酒的酒精度缓慢上升，当主发酵温度为16 ℃时，酒精度值为15.2%vol，但变化不显著（P＞0.05）。主发酵温度在12～14 ℃范围内时，感官评分逐渐增加；主发酵温度为14 ℃时，感官评分最高，为85分，主发酵温度高于14 ℃后，感官评分下降。综合考虑，选择最佳主发酵温度为15 ℃。

2.1.4 料水比的确定

料水比对新型黄酒感官评分和理化指标的影响见图4。

由图4可知，随着液体占比的增加，新型黄酒中的氨基酸态氮含量逐渐减少，料水比为1∶0.8（g∶mL）时，氨基酸态氮含量为0.61 g/L。料水比在1∶1.0～1∶1.2范围内时，非糖固形物含量增加；当料水比为1∶1.2时，非糖固形物含量达到最高值，为25.8 g/L；料水比超过1∶1.2之后，非糖固形物含量迅速下降。当料水比在1∶0.8～1∶1.0范围内，酒精度增加；当料水比为1∶1.0时，酒精度达到最高值，为16.1%vol；料水比在1∶1.0～1∶1.6范围内时，酒精度下降，其原因可能是加水量过少时，发酵液被稀释，影响发酵速度[26]。当料水比在1∶0.8～1∶1.4范围内，感官评分逐渐增加；料水比为1∶1.2和1∶1.4时，感官评分最高，均为80分；料水比为1∶1.6时，感官评分下降。综合考虑，选择最佳料水比为1∶1.4（g∶mL）。

图4 料水比对新型黄酒感官评分和理化指标的影响Fig.4 Effect of solid and liquid ratio on sensory scores and physicochemical indexes of new-type Huangjiu

2.2 新型黄酒发酵工艺优化响应面优化试验结果

2.2.1 响应面试验设计及结果

固定日本清酒酵母的添加量为3%。在单因素试验的基础上，确定米麦曲添加量（A）、主发酵温度（B）、料水比（C）为考察因素，以总加权评分值作为响应值（Y），利用Design-Expert 8.0.6软件设计3因素3水平响应面试验，响应面试验结果见表3，方差分析见表4。根据表3结果，利用Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行多元回归拟合，得到二次回归方程：

表3 新型黄酒发酵工艺优化响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface tests for fermentation process optimization of new-type Huangjiu

由表4可知，该模型P=0.000 6＜0.01，表明该模型极显著，失拟项P=0.088 1＞0.05，说明失拟程度不显著，即该试验数据与模型拟合良好，该回归方程可用。模型决定系数R2=0.955 6，表明该回归模型有着很好的拟合效果。模型调整决定系数R2adj=0.898 5，说明此模型可以解释89.85%响应值变化。模型决定系数和调整系数比较接近，说明该模型的预测性良好，试验误差小。决定变异系数（coefficient of variation，CV）为6.49%，说明试验数据离散程度可以接受。该模型可用于预测新型黄酒的总加权评分值。回归方程的方差分析结果表明，二次项A2、B2、C2对响应值影响极显著（P＜0.01），一次项A、B、C和交互项AB对响应值的影响显著（P＜0.05）。交互项AC、BC对响应值影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，影响总加权评分值的因素大小排序为C＞B＞A，即料水比＞主发酵温度＞米麦曲添加量。

表4 回归模型方差分析Table 4 Variances analysis of regression model

2.2.2 响应面交互作用分析

响应曲面图坡度变化越陡，等高线密集且成椭圆形，则表示两因素交互作用显著。根据响应曲面及其等高线图可评价影响因素之间的相互作用及其对总加权评分的影响，以确定各因素的最佳水平范围。各因素交互作用对总加权评分值影响的响应曲面和等高线见图5。

图5 各因素间交互作用对新型黄酒总加权评分值影响的响应曲面及等高线Fig.5 Response surface plots and counter lines of effects of interactions between various factors on total weighted score value of new-type Huangjiu

由图5可知，由图5a可知，因素A与因素B所形成的响应曲面坡度陡峭，表明米麦曲添加量与主发酵温度之间的交互作用较强，影响显著（P＜0.05）；由图5b可知，因素A与因素C所形成的响应曲面坡度较平缓，表明料水比与米麦曲添加量之间有交互作用，但交互作用不显著（P＞0.05）；由图5c可知，因素B与因素C所形成的响应曲面坡度平缓，表明主发酵温度与料水比之间的交互作用不强，差异不显著（P＞0.05），这与表5方差分析的结果一致。

2.2.3 验证试验

对Design Expert 8.0.6得出的拟合函数求解，得到新型黄酒酿造的最佳工艺条件为：米麦曲添加量20.42%，主发酵温度14.54 ℃，料水比1∶1.36（g∶mL），此条件下新型黄酒总加权评分理论值为84.28分。为了验证响应面试验优化的结果，且考虑到实际操作的方便可行性，将新型黄酒发酵工艺条件修正为：米麦曲添加量20%，主发酵温度15 ℃，料水比1.0∶1.4（g∶mL）。在此条件下进行5次平行试验，去除两组偏差较大的数据后，得到总加权评分平均实际值为84.0分。试验结果表明，此发酵工艺的实测值与理论值相近，具有一定的实际应用价值。采用该工艺条件制备的新型黄酒氨基酸态氮含量为0.40 g/L、非糖固形物含量为25.28 g/L、酒精度为15.18%vol、pH值为4.21。酒体呈淡黄色，清亮透明，有光泽，无沉淀物和杂质；具有黄酒特有的醇香，有纯正、优雅、和谐的香气；口味鲜美爽口、醇厚柔和，无异味；同时具有典型的清酒和黄酒的风格，酒体协调柔和；酒精度下降，减淡了消费者饮用时的杀口感，酒品更清爽，更适合大众口味。

2.3 新型黄酒品质分析

黄酒质量控制和决定风味的主要指标是酒精度、总糖和氨基酸态氮[27]。当前，将风味物质的化学分析与感官评价相结合，尤其是滋味物质与黄酒感官特性的相关性研究鲜见报道[28]。在半干型黄酒（一级）[23]基础上，考虑酒体口感，防止过甜或过酸（涩）。同时，从维护自然酿造黄酒的角度出发，新型黄酒进行品质分析，结果见表5。

表5 新型黄酒品质分析Table 5 Quality analysis results of new-type Huangjiu

由表5可知，新型黄酒的酒精度、pH值、非糖固形物含量和氨基酸态氮含量等质量指标均满足GB/T 13662—2018《黄酒》中半干型黄酒（一级）标准。

3 结论

通过单因素试验及响应面试验优化新型黄酒酿造工艺条件。结果表明，新型黄酒的最佳发酵工艺条件为：日本清酒酵母添加量3%、米麦曲添加量20%、主发酵温度15 ℃、料水比1∶1.4（g∶mL）。在此优化条件下，新型黄酒的总加权评分平均值为84.0分，氨基酸态氮含量为0.40 g/L、非糖固形物含量为25.28 g/L、酒精度为15.18%vol、pH值为4.21。酒体呈淡黄色，清亮透明，有光泽，具有黄酒特有的醇香，口味鲜美爽口酒体协调柔和，酒精度下降，减淡了消费者饮用时的杀口感，更适合大众口味。