没食子酸对金线鱼鱼糜凝胶特性及其体外消化产物活性的影响

钟坦君，洪鹏志,2，周春霞,2,*，宋春勇，肖丁浩，张若兰，刘 璐

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，广东省海洋食品工程技术研究中心，广东省现代农业科技创新中心，广东省海洋生物制品工程实验室，广东 湛江 524088；2.大连工业大学 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁 大连 116034）

鱼糜是一种稳定的肌原纤维蛋白浓缩物，由于其独特的凝胶性，可以加工成各种鱼糜制品，例如鱼糕、鱼丸和鱼肠等，深受消费者喜爱。鱼糜制品具有高蛋白、低脂肪、高营养性和味美等特点，能够满足不同消费者的消费需求。据2020年中国渔业年鉴统计，我国鱼糜制品的加工量为139.4万 t，仅占水产品加工量的6.4%，具有巨大的开发潜力。金线鱼肉质鲜美、营养价值高、产量大且热凝胶特性好，是加工成鱼糜及鱼糜制品的主要海水鱼原料之一。近年来，随着生活水平的提高，人们对健康性、营养性的功能食品需求量日益增加。可作为优质蛋白来源的鱼糜制品具有良好的市场前景。因此，开发高品质的鱼糜制品势在必行。

越来越多的研究将多酚类物质用于改善鱼糜凝胶性能。多酚类物质大都具有较强的抗氧化性，能够对氧化损伤导致的慢性疾病，如心血管疾病等起到预防作用，且多酚能够促进蛋白质的交联，从而利于蛋白质形成更为稳定的凝胶网络结构。用酪氨酸酶和单宁酸混合处理沙丁鱼鱼糜凝胶得到更细密的凝胶网络结构，适宜添加量的咖啡酸或绿原酸能够增强马鲛鱼鱼糜凝胶性质。没食子酸化学名称为3,4,5-三羟基苯甲酸，是化学结构最简单的天然多酚类化合物，具有抗氧化、抗炎、降血脂、降血糖等多种生物活性，常作为一种低分子质量的天然抗氧化剂而广泛使用。张旭等研究发现没食子酸能显著降低谷氨酸钠诱导的肥胖小鼠的血脂水平；Rafiee等研究发现具有供电子羧酸阴离子的没食子酸比联苯三酚具有更强的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）自由基清除能力。此外，没食子酸能与蛋白质发生共价和非共价结合，引起蛋白质结构的变化，从而改变蛋白质的凝胶特性。研究表明，超声波辅助没食子酸可有效改善海鲈鱼肌原纤维蛋白的凝胶强度和质构特性，添加0.15%没食子酸使海鳗肌原纤维蛋白-螺旋和-折叠含量增加，形成的凝胶结构更为致密光滑。因此，在鱼糜中添加没食子酸可以改善鱼糜的凝胶特性，有望开发功能性鱼糜制品，且效果与添加量有关。

然而，在食品加工或食物消化过程中，胃肠道蛋白酶的作用会使一些多酚发生解聚，导致其生物活性改变。经胃肠道消化后，牛至多酚抗氧化活性和-葡萄糖苷酶抑制活性降低，胰脂肪酶抑制活性增强，含树莓和覆盆子的面条自由基清除率增加了4 倍。目前，添加到鱼糜制品中的活性成分受加工和消化的影响尚不明确。因此，本研究以金线鱼鱼糜为原料，添加没食子酸，研究其添加量对金线鱼鱼糜凝胶特性和分子间化学作用力的影响，通过体外模拟消化模型评估添加没食子酸后鱼糜凝胶消化产物的体外抗氧化活性和降胆固醇作用，为新型功能性鱼糜制品的研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷冻金线鱼鱼糜购自北海丰华食品有限公司（2020年8月批次，AAA级，水分质量分数为73.91%）。

没食子酸、胃蛋白酶（1∶15 000）、胰蛋白酶（250 U/mg） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胆盐（胆酸含量≥60%）、胆固醇酯酶（49 U/mg）、胆固醇棕榈酸酯、牛黄胆酸钠、胆固醇、油酸、DPPH、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）上海源叶生物科技有限公司；总胆固醇试剂盒、游离胆固醇试剂盒 苏州格锐思生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UMC5斩拌机 德国Stephan公司；TU-20T恒温水浴锅 英国Bibby Scientific公司；TA.XT plusC质构仪英国Stable Micro Systems公司；色差仪 深圳市3nh科技公司；NMI20-060H-I核磁共振成像分析仪 苏州纽曼分析仪器公司；Avanti J-26sxp高速落地冷冻离心机美国Beckman公司；7610F扫描电子显微镜 日本电子公司。

1.3 方法

1.3.1 鱼糜凝胶的制备

参考Buamard等的方法制备金线鱼鱼糜凝胶。将冷冻鱼糜置于4 ℃解冻8～10 h，称取300 g鱼糜，斩拌10 s，加入质量分数2.5%的NaCl斩拌2 min，分别添加质量分数0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的没食子酸粉末，调节水分质量分数80%，继续斩拌3 min。斩拌均匀的鱼糜混合物经抽真空、灌肠、密封后，进行二段式热处理（40 ℃，30 min；90 ℃，20 min）、冰水冷却至室温，4 ℃保存过夜。以不添加没食子酸的鱼糜凝胶为对照组。

1.3.2 凝胶强度和凝胶全质构的测定

将鱼糜凝胶置于室温平衡30 min，剥去肠衣，切成20 mm高圆柱体。用配有探头P/0.5和P/0.5 S的质构仪分别测定凝胶强度和全质构。参数设定为：测前速率5 mm/s，测中速率1 mm/s，测后速率1 mm/s，触发力5 g，压缩距离10 mm，应变50%。每个样品测6 次取平均值。

1.3.3 凝胶白度的测定

采用色差仪测定凝胶的白度。将凝胶在室温下平衡30 min，剥去肠衣，切成10 mm薄片，测定其、、，其中*表示样品的亮度，*表示红/绿值，*表示黄/蓝值。每个样品测5 次取平均值。凝胶白度（）按式（1）计算：

1.3.4 凝胶持水性的测定

采用离心法测定鱼糜凝胶的持水性。精确称取凝胶质量（约3 g），用双层滤纸包裹，放入50 mL离心管中离心（10 000 r/min，10 min），取出凝胶称质量，记为。每个样品测5 次取平均值。凝胶持水性按式（2）计算：

1.3.5 凝胶微观结构的观察

将鱼糜凝胶切成约2 mm薄片，用2.5%，pH 6.8戊二醛溶液浸泡固定，4 h后用磷酸盐缓冲溶液（0.1 mol/L，pH 6.8）洗涤2 次，每次15 min，依次用梯度乙醇溶液洗脱，每次10 min，随后按无水乙醇-叔丁醇体积比1∶1比例及纯叔丁醇各洗涤1 次，每次15 min，冷冻干燥，贴样，镀金，加速电压10 kV下放大18 000 倍观察。

1.3.6 化学作用力的检测

参考Liu Haimei等的方法检测鱼糜凝胶的化学作用力。配制5 种溶液，即0.05 mol/L NaCl（A液）、0.6 mol/L NaCl（B液）、0.6 mol/L NaCl＋1.5 mol/L尿素（C液）、0.6 mol/L NaCl＋8 mol/L尿素（D液）、0.6 mol/L NaCl＋8 mol/L尿素＋0.5 mol/L-巯基乙醇（E液）。准确称取2.0 g鱼糜凝胶样品5 份，分别加入上述溶液10 mL，匀浆均质3 min，4 ℃冰水浴条件下磁力搅拌溶解1 h后离心（10 000h，15 min），采用Lowry测上清液的蛋白含量，分别用S1、S2、S3、S4、S5表示。每个样品测5 次取平均值。离子键、氢键、疏水相互作用、二硫键含量分别为：离子键=S2－S1；氢键＝S3－S2；疏水相互作用＝S4－S3；二硫键＝S5－S4；结果以每毫升溶液所含的溶出蛋白质量表示（mg/mL）。

1.3.7 凝胶的体外消化

参照Minakus等标准化体外静态模拟消化方法并稍作修改。按照表1分别配制模拟胃液（simulated gastric fluid，SGF）、模拟肠液（simulated intestinal fluid，SIF）原液，进行体外模拟胃-肠两步消化。

表1 模拟消化液原液的配制Table 1 Preparation of stock solutions of simulated digestion fluids

模拟胃消化阶段：取10 g绞碎的鱼糜凝胶，加入10 mL蒸馏水摇匀后与20 mL模拟胃液（含19 mL SGF原液、0.3 mg CaCl、60 mg胃蛋白酶）混合均匀，用1 mol/L的HCl溶液或者1 mol/L的NaOH溶液调pH 2.0，37 ℃振荡水浴2 h，反应结束后用0.5 mol/L的NaHCO溶液调节pH 7.0。

模拟肠消化阶段：取40 mL上述胃消化液，加入40 mL模拟肠液（含39 mL SIF、32 mg胰蛋白酶、327 mg胆盐、0.6 mg CaCl）混合均匀，37 ℃振荡水浴2 h，反应结束后用2 mol/L HCl溶液调pH 2.0，8 000h离心15 min，收集上清液，用于消化产物的活性检测。

体外消化率按式（3）计算：

式中：为消化液总体积/mL；为消化液上清液中蛋白质质量浓度/（mg/mL）；为消化所用凝胶质量/mg；为凝胶中蛋白质质量分数/%。

1.3.8 经体外消化后消化产物的抗氧化活性检测

DPPH自由基清除率参考Spripokar等的方法：取1.3.7节的消化液（0.5 mL）与50 μg/L的DPPH工作液（2.5 mL）混合，室温避光静置30 min后在517 nm波长下测吸光度。DPPH自由基清除率按式（4）计算：

式中：为未加样品溶液的吸光度；A为加样品溶液后的吸光度。

ABTS法根据Solari-Godino等的方法做适当修改。ABTS溶液（7 mmol/L）与过硫酸钾溶液（2.45 mmol/L）按2∶1比例混合，室温避光静置12～16 h，制得ABTS原液。使用时用蒸馏水稀释，使其在734 nm波长下吸光度为0.70f0.02。0.05 mL待测样品与2.9 mL ABTS工作液混合均匀，室温避光10 min，734 nm波长下测吸光度。ABTS阳离子自由基清除率按式（5）计算：

式中：为未加样品溶液的吸光度；A为加样品溶液后的吸光度。

羟自由基清除活性参考邓永平等的方法并略作修改。试管中加入1 mL硫酸亚铁溶液（10 mmol/L），2 mL HO溶液（10 mmol/L），2 mL水杨酸-乙醇溶液（5 mmol/L），摇匀后加入5 mL样品溶液，37 ℃反应30 min，在510 nm波长下测吸光度。羟自由基清除率按式（6）计算：

式中：为未加样品溶液的吸光度；A为加样品溶液后的吸光度。

1.3.9 经体外消化后消化产物的降胆固醇活性检测

对胆固醇酯酶活性的影响：参考朱维等的方法，配制胆固醇棕榈酸酯底物缓冲液（5.16 mmol/L胆固醇棕榈酸酯、100 mmol/L磷酸盐缓冲液、100 mmol/L NaCl，pH 7.0），37 ℃预热10 min，按样品与底物缓冲液体积比1∶5混合均匀，加入1 mL猪胆固醇酯酶（0.1 mg/mL，50 U/mg），振荡水浴1 h。采用游离胆固醇试剂盒检测生成的胆固醇含量。胆固醇酯酶抑制率按式（7）计算：

式中：为未加样品溶液中胆固醇含量；A为样品溶液中胆固醇含量。

对胆固醇胶束化的抑制作用：参考张宇等的方法，通过超声均质制备胆固醇胶束溶液。1 mL胆固醇胶束溶液中含有10 mmol/L牛黄胆酸钠、5 mmol/L胆固醇、5 mmol/L油酸、132 mmol/L NaCl、15 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。取5 mL胶束溶液加入1 mL鱼糜凝胶消化液，37 ℃恒温振荡水浴2 h后离心（10 000 r/min，15 min），收集上清液，使用试剂盒测总胆固醇含量。胆固醇胶束化抑制率按式（8）计算：

式中：为未加样品溶液中胆固醇含量；A为样品溶液中胆固醇含量。

1.4 数据统计

3 次独立实验（不同日期）平均值使用SPSS 19.0进行方差分析，并采用Duncan多重检验分析各个平均值之间的显著性差异（＜0.05）。使用Origin 9.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 添加没食子酸对金线鱼鱼糜凝胶性能的影响

2.1.1 鱼糜凝胶强度和质构特性

凝胶强度和破断强度是评价鱼糜制品质量的重要参数，反映了鱼糜形成热致凝胶的能力。如表2所示，随着没食子酸添加量的增加，鱼糜凝胶强度先增大后减小，凝胶强度和破断强度均在0.15%时达到最大；鱼糜凝胶的硬度、内聚性、咀嚼性和回复性均呈先增大后减小趋势。当没食子酸添加量为0.1%时，鱼糜凝胶的硬度最大；当没食子酸的添加量为0.15%时鱼糜凝胶的内聚性、咀嚼性和回复性最大。与空白组相比，添加没食子酸显著提高鱼糜凝胶的弹性（＜0.05），而没食子酸的添加量对凝胶胶着性影响不显著（＞0.05）。综合全质构指标分析，没食子酸的添加量为0.15%最有利于改善鱼糜凝胶的质构。

表2 添加没食子酸对金线鱼鱼糜凝胶强度和质构特性的影响Table 2 Effect of gallic acid addition on the texture properties of N.virgatus surimi gel

多酚可与鱼糜蛋白质发生相互作用改变鱼糜的凝胶特性。酚类物质氧化成醌，与巯基共价结合对蛋白质的凝胶特性有两方面的影响。当多酚浓度较低时，多酚与巯基发生非二硫共价交联，生成蛋白质-硫-多酚-硫-蛋白质交联物，在蛋白质分子间起连接作用，增加蛋白间的聚合，从而提高鱼糜凝胶强度、破断强度、硬度、弹性、内聚性、咀嚼性和回复性；当多酚浓度较高时，多酚与巯基交联过度，不利于凝胶形成过程中二硫键的形成，因而不利于凝胶网络的形成。此外，低浓度多酚能够增强鱼糜凝胶的疏水相互作用，有利于鱼糜蛋白质的凝胶化；而高浓度的多酚使蛋白质发生疏水性聚集，并且过剩的多酚物质屏蔽肌原纤维蛋白中的巯基、氨基等反应性官能团，阻碍蛋白之间的交联，使鱼糜蛋白形成无序、松散的网络结构，由此降低鱼糜凝胶的质构特性。本研究中，当没食子酸添加量为0.15%时，可显著提高鱼糜凝胶强度、破断强度和质构特性，而当没食子酸的添加量继续增加时，鱼糜凝胶的凝胶强度和质构特性明显减弱。因此，高浓度的没食子酸不利于鱼糜凝胶的形成。

2.1.2 鱼糜凝胶的白度

白度是鱼糜制品的重要感官指标，白度越高，消费者越容易接受。一般来说，鱼糜制品要求高亮度（*）、低黄度（*）和高白度。如表3所示，未添加没食子酸的鱼糜凝胶白度显著高于添加没食子酸后的鱼糜凝胶（＜0.05）。随着没食子酸添加量的增加，鱼糜凝胶的亮度和黄度均显著降低。因此，没食子酸主要对鱼糜凝胶的亮度不利，从而导致白度降低。这可能是没食子酸在加热过程中氧化成醌，颜色加深，从而使鱼糜凝胶白度降低。Vate等报道在沙丁鱼鱼糜中加入单宁酸，由于单宁酸的自我氧化导致鱼糜凝胶白度降低。与此类似，Arsyad等在红鲷鱼鱼糜凝胶中加入橄榄叶粉末，因橄榄多酚的作用导致鱼糜凝胶的白度降低。以上结果表明，加入酚类物质会导致鱼糜凝胶的白度降低。因此，应通过控制酚类的添加量将鱼糜制品的白度控制在可接受水平。

表3 添加没食子酸对金线鱼鱼糜凝胶白度的影响Table 3 Effect of gallic acid addition on the color parameters and whiteness of N.virgatus surimi gel

2.1.3 鱼糜凝胶的持水性

持水性指鱼糜凝胶中蛋白质的保水能力，与凝胶网络结构的强度有关。一般来说，凝胶网络结构越致密，其截留水分的能力越好，持水性就越高。如图1所示，与对照组相比，添加0.05%、0.10%和0.15%的没食子酸对鱼糜凝胶持水性的影响不明显（＞0.05），而当没食子酸的添加量增加到0.2%和0.25%时，鱼糜凝胶的持水性显著降低（＜0.05），表明高添加量的没食子酸对鱼糜凝胶的持水性有不利影响，与没食子酸的添加对凝胶强度和质构特性的影响一致。没食子酸与鱼糜蛋白分子间相互作用，高浓度的多酚与蛋白质分子过度结合，破坏蛋白质空间结构，引起不良聚集，导致凝胶网络松散，体系的持水性下降。与此类似，低添加量（10 μmol/g）的没食子酸对肌原纤维蛋白凝胶持水性影响不显著，而当没食子酸添加量为50 μmol/g时，肌原纤维蛋白凝胶持水性显著降低；低浓度绿原酸和咖啡酸能显著提高马鲛鱼鱼糜凝胶的持水性，而当浓度增加时，由于多酚的结合作用引起蛋白质间过度交联而使持水性降低。因此，添加适量的没食子酸对鱼糜凝胶的持水性没有不利影响。

图1 添加没食子酸对金线鱼鱼糜凝胶持水性的影响Fig.1 Effect of gallic acid addition on the water-holding capacity of N.virgatus surimi gel

2.1.4 鱼糜凝胶的微观结构

由图2可知，空白对照组鱼糜凝胶表面粗糙，孔洞较多且大小不均匀（图2A）。添加0.05%的没食子酸后，鱼糜凝胶表面较粗糙，但表面孔径变小（图2B）；添加0.10%没食子酸后，鱼糜凝胶样品表面光滑，孔径小且均匀，但表面孔洞较多（图2C）；添加0.15%没食子酸后，鱼糜凝胶结构变得紧实致密，孔洞相对较少，但表面较粗糙（图2D），说明适当添加量的没食子酸可以促进鱼糜凝胶网状结构的形成。在鱼糜中分别添加0.3%间苯三酚和1%褐藻多酚提取物可与蛋白质生成共价键，起到“架桥”作用，增强蛋白质分子间的交联，从而导致鱼糜凝胶表面孔径变小。研究表明，肌原纤维蛋白的交联与凝胶强度和硬度有关，凝胶网络越细密紧致，凝胶硬度越大。此外，蛋白网络结构越精细，鱼糜凝胶孔径越小，越能捕获更多的水分子，从而使鱼糜凝胶具有更高的弹性和持水性。随着没食子酸添加量的进一步增加，鱼糜凝胶表面孔洞变多，孔径变大，结构变得松散无序（图2E、F）。与质构特性的检测结果类似，含0.10%和0.15%没食子酸的金线鱼鱼糜凝胶具有更高的凝胶强度、硬度和持水性，而当没食子酸添加量超过0.15%时，鱼糜的凝胶强度、硬度和持水性等都减小，这可能是由于高浓度的没食子酸阻碍蛋白质分子间的相互作用，从而使蛋白结构分布不均匀，凝胶表面空隙增大。

图2 添加没食子酸对金线鱼鱼糜凝胶扫描电镜图的影响（×18 000）Fig.2 Effect of gallic acid addition on the scanning electron microscopic photograph of N.virgatus surimi gel (× 18 000)

2.2 鱼糜凝胶的化学作用力

影响鱼糜凝胶结构稳定性的化学作用力主要是离子键、氢键、疏水相互作用、二硫键。如图3所示，鱼糜凝胶的形成过程中，共价二硫交联的作用贡献最大，其次是非共价的疏水相互作用，而离子键和氢键的作用贡献较小。随着没食子酸添加量的增加，离子键和氢键呈上升趋势。维持鱼糜凝胶的疏水相互作用和二硫键含量随着没食子酸添加量的增加呈现先上升后下降的趋势，并均在添加量为0.15%时达到最大。这是由于适量的没食子酸促进蛋白质展开，使表面疏水性适度增加，而高添加量的没食子酸会使蛋白质聚集甚至变性，蛋白质进一步折叠使疏水性氨基酸埋藏在内部，从而使疏水相互作用呈现先增加后减小的趋势。二硫键是由相邻的2 个半胱氨酸分子氧化后形成，说明适量没食子酸能够改变鱼糜蛋白质内部结构，暴露出更多的巯基，多酚再将其氧化成二硫键，从而使二硫键含量增加；当没食子酸含量较高时，没食子酸与蛋白质结合过度，阻碍凝胶形成过程中巯基向二硫键的转化，从而减少二硫键的生成。总体分析，二硫键才是鱼糜凝胶形成过程中主要的化学作用力，且没食子酸主要通过影响蛋白质分子间的二硫共价交联改变鱼糜的凝胶特性。

图3 添加没食子酸对金线鱼鱼糜凝胶化学作用力的影响Fig.3 Effect of gallic acid addition on the chemical forces of N.virgatus surimi gel

2.3 没食子酸的添加对金线鱼鱼糜凝胶体外消化的影响

2.3.1 鱼糜凝胶的体外消化率

体外模拟消化模型可用于模拟食物在人体中的消化过程，研究在模拟胃肠道环境下食物中营养成分的消化率和释放行为。其中蛋白质体外消化率直接定量反映食物中蛋白质在胃肠道中的消化情况，进而反映没食子酸添加量对蛋白质消化程度的影响。由图4可知，添加没食子酸后，金线鱼鱼糜凝胶的蛋白质体外消化率均明显提高（＜0.05），且当没食子酸添加量为0.15%时，蛋白质的体外消化率最高为86.30%。说明没食子酸的作用有助于鱼糜凝胶的消化。

图4 添加没食子酸对金线鱼鱼糜凝胶蛋白质体外消化率的影响Fig.4 Effect of gallic acid addition on the in vitro protein digestibility of N.virgatus surimi gel

研究认为，多酚能与蛋白质结合，降低蛋白质的消化率。然而，对于小分子多酚类化合物，比如没食子酸和表没食子儿茶素没食子酸酯对蛋白消化性能的影响报道结果与此并不一致。曹云刚研究发现，添加没食子酸促使猪肌原纤维蛋白热诱导凝胶二硫键及其他共价键的生成，但对肌原纤维蛋白的体外消化率没有显著影响。Shen Fei等研究发现，茶多酚与卵清蛋白和溶菌酶的非共价结合提高了2 种蛋白的胃蛋白酶消化率，但降低了其胰酶消化率。消化过程中胃蛋白酶的活性起着至关重要的作用，胃蛋白酶的主要酶切位点为酪氨酸、色氨酸等疏水性氨基酸。少量没食子酸的添加能提高蛋白质消化率的原因可能是没食子酸的苯环与鱼糜蛋白质分子内部的芳香族氨基酸相互作用，使蛋白质分子结构展开，疏水性基团暴露，利于胃蛋白酶的酶切作用，从而使蛋白质的消化率增加，而当没食子酸浓度较高时，蛋白质聚集，不利于胃蛋白酶的酶切作用，这与维持鱼糜凝胶的分子间疏水相互作用的变化规律相符。此外，由于没食子酸的抗氧化作用，空白组的鱼糜凝胶蛋白更易发生氧化，进而抑制与消化酶的结合，导致其消化率低。

2.3.2 体外消化产物的抗氧化活性

采用DPPH自由基清除率、ABTS阳离子自由基清除率和羟自由基清除率，测定鱼糜凝胶消化物的抗氧化活性。如图5所示，未添加没食子酸的鱼糜凝胶体外消化产物具有较高的DPPH自由基清除率（41.75%）和羟自由基清除率（72.81%），这是因为鱼糜中的蛋白质经消化后产生的多肽或游离氨基酸可能具有多种生物活性，如Minkiewicz等发现鲤鱼蛋白消化产物具有较好的血管紧张素转化酶抑制活性，并从中分离出了ACE抑制肽。添加0.05%的没食子酸后，鱼糜凝胶体外消化产物的DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和ABTS阳离子自由基清除率均显著提高（＜0.05），表明添加到鱼糜中的没食子酸经过热处理和体外消化后保留了自身的抗氧化活性。而随着没食子酸添加量的增加，DPPH自由基和羟自由基清除率变化不明显，而ABTS阳离子自由基清除率随添加量的增加显著增加（＜0.05），没食子酸添加量为0.25%时，ABTS阳离子自由基清除率达到93.78%。由此说明ABTS阳离子自由基清除率可能更适合于评价此鱼糜凝胶样品的抗氧化能力，这可能是由于反应机制的不同导致不同的结果。与此类似，在凤尾鱼肉糜中添加富含多酚的葡萄渣膳食纤维，肉糜的体外ABTS阳离子自由基清除率随着膳食纤维添加量的增加而显著上升，而铁离子还原能力增加趋势不明显。综合分析，添加没食子酸能够增强鱼糜凝胶体外消化产物的抗氧化活性，并且低添加量的没食子酸即可获得较强的DPPH自由基和羟自由基清除能力。大量研究已经证实，自由基引起的氧化损伤与人类的各种慢性和退行性疾病的发病机制密切相关，因此添加没食子酸的鱼糜凝胶制品可能对人体具有潜在的健康益处。

图5 添加没食子酸对金线鱼鱼糜凝胶体外消化产物抗氧化活性的影响Fig.5 Effect of gallic acid addition on the antioxidant activity of in vitro digested N.virgatus surimi gel

2.3.3 体外消化产物的降胆固醇作用

通过摄食进入人体的胆固醇有游离胆固醇和胆固醇酯2 种形式，胆固醇酯需要在胆固醇酯酶的作用下水解成游离胆固醇和脂肪酸后才能进入消化系统。此外，胆固醇酯酶促进胆固醇胶束化、有助于游离胆固醇向肠细胞的转运。因此，抑制胆固醇酯酶活性可在一定程度上减少胆固醇吸收，起到降血脂作用。没食子酸的添加对鱼糜凝胶体外消化产物抑制胆固醇酯酶活性的影响如图6A所示。未添加没食子酸的鱼糜凝胶体外消化产物对胆固醇酯酶活性的抑制率为27.43%，添加0.05%没食子酸后，鱼糜凝胶对胆固醇酯酶抑制率增加到52.10%，此后随着没食子酸添加量的增加呈现缓慢减小的趋势，当添加量增加到0.25%时，抑制率降低到43.60%。这表明鱼糜凝胶对胆固醇酯酶的抑制率可能与凝胶性质有关，当多酚含量较高时，多酚与蛋白过度结合，降低蛋白消化率，从而减弱消化产物的功能活性。

图6 添加没食子酸对金线鱼鱼糜凝胶体外降胆固醇作用的影响Fig.6 Effect of gallic acid addition on the cholesterol-lowering capacity of in vitro digested N.virgatus surimi gel

经水解后的胆固醇只有溶于混合胶束后才能被运输到小肠中吸收，本实验通过模拟胆汁胶束，研究鱼糜凝胶体外消化产物对胆固醇吸收的影响。如图6B所示，未添加没食子酸的鱼糜凝胶体外消化产物对胆固醇胶束化抑制率较低（19.15%），添加没食子酸后，鱼糜凝胶体外消化产物对胆固醇胶束化抑制作用随着没食子酸添加量的增加而显著增强（＜0.05），当没食子酸添加量为0.25%时抑制率达到最大为55.99%。与之相比，乳清蛋白活性肽对胆固醇胶束化抑制率为47.82%，张氏马尾藻多糖对胆固醇胶束抑制率最高为18.74%。

长期摄入含酚类成分的食物能够降血压、降血脂，推测其原因在于减少了肠道对胆固醇的吸收。Boruah等以不同剂量的大黄叶多酚粗提物喂养高血脂大鼠，结果发现此多酚促进了大鼠胆固醇的排泄，使大鼠血浆中高密度脂蛋白胆固醇含量显著升高、低密度脂蛋白胆固醇和极低密度脂蛋白含量显著降低。综合分析，本实验所制备的没食子酸鱼糜凝胶具有较好的体外模拟降胆固醇效果，体外消化产物对胆固醇胶束的形成具有较强抑制作用，能够减少胆固醇的吸收，从而起到降脂作用。

3 结 论

适量的没食子酸能够促进鱼糜蛋白分子间的共价交联，增强凝胶形成过程中的疏水相互作用和二硫交联，从而有利于形成致密均匀的凝胶网络结构，改善凝胶品质，也能提高鱼糜凝胶中蛋白质的体外消化率，且消化产物的体外抗氧化活性和体外降胆固醇活性明显提高；而较高添加量的没食子酸与鱼糜蛋白过度交联，使蛋白质变性聚集，阻碍二硫键的形成，不利于凝胶形成，但体外消化产物的活性仍然保持较好，表明没食子酸添加到鱼糜中经热处理和体外消化后仍保留了自身的生物活性。当没食子酸添加量为0.15%时，鱼糜凝胶性能最佳，体外消化产物的抗氧化活性、胆固醇酯酶抑制活性和胆固醇胶束化抑制活性较强。因此，凝胶体系对酚类物质具有一定的稳态化作用，适量没食子酸可作为鱼糜凝胶品质改良剂和负载的功能活性成分。