两类新疆狗牙根抗旱基因型抗氧化酶保护系统及其基因表达差异分析

曾令霜，李培英，2*，孙宗玖，2*，孙晓梵

（1. 新疆农业大学草业与环境科学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2. 新疆草地资源与生态重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830052）

随着全球气候变化的加剧及水资源短缺的问题日益突出，干旱已成为制约生态环境建设、植物分布和生产力的世界性问题［1-3］，严重影响植物的生长和持久性［3］。但植物能通过在形态、生理生化和分子水平上整合各种反应和适应机制来响应干旱胁迫，以维持正常的生长发育［4］。狗牙根（Cynodon dactylon）作为分布及应用最为广泛的草坪草之一，具有较强的避旱性或耐旱性，是抗旱节水的首选草种之一［5］，被认为是一种具有基因型变异的耐旱品种［6］。研究狗牙根对干旱胁迫的适应及响应机制将有助于为植物栽培及育种提供增强抗旱性的措施和依据。

抗氧化系统在植物响应干旱胁迫中发挥着重要作用，干旱胁迫促进了植物体内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的积累，ROS 过量积累引起氧化应激反应［7］，导致脂质过氧化、蛋白质变性、DNA 突变和各种细胞氧化损伤［8］。但植物自己也有清除ROS 的策略，为此形成了一套由抗氧化酶和非抗氧化酶组成的抗氧化体系［9］，其中调节抗氧化酶的活性或相关基因表达被认为是最有效的ROS 清除策略之一［10］。据报道，干旱胁迫下植物通过积累更多抗氧化剂或减少脂质过氧化，以应对干旱胁迫，从而减轻干旱胁迫的不利影响［11］。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是清除ROS 中第一个激活酶，能够清除超氧阴离子自由基（O2·-）产生H2O2和O2，随后过氧化氢酶（catalase，CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、过氧化物酶（peroxidase，POD）清除H2O2［12］，但不同干旱程度、不同物种以及不同品种之间干旱胁迫过程中ROS 及抗氧化酶变化存在一定差异［13］，而关于不同干旱强度及复水后狗牙根的抗氧化酶活性变化及其与脂类过氧化反应的内在联系的研究较少。且不同耐旱性的狗牙根基因型在抗氧化防御系统、脂质过氧化的比较可能有助于更好地理解耐旱性。

干旱胁迫也会对植物的抗氧化酶基因在转录水平上造成影响，明确干旱胁迫下植物在转录或转录后水平的抗氧化系统酶的变化差异对抗氧化防御策略至关重要［14-15］。最近的研究发现，一种新的CuZn SOD 酶由OsCSD3（LOC_Os03g11960）编码，在干旱、氧化应激和盐胁迫中被上调［16］。SOD、APX以及DHAR基因的表达量高于不抗旱基因型C299［17］。而在新疆不同抗旱性狗牙根间是否存在相似或不同的适应机制还有待进一步研讨，且狗牙根在干旱胁迫前后的分子水平变化尚不清楚，取得的研究成果也相对有限。

新疆地处中国内陆，气候干燥炎热，由于不同的农业生态系统，新疆狗牙根具有发达的根状茎和细长的匍匐茎，具有良好的抗旱性，在先前的研究中发现，新疆狗牙根在耐旱性方面表现出广泛的遗传变异性，43 份狗牙根种质中C138 在耐旱性方面排名第2，C32 在耐旱性方面排名第42［18］。识别和理解抗氧化的功能防御机制对于发展及筛选耐旱的狗牙根植物具有重要意义。为此，本研究选取2 个抗旱性显著不同的狗牙根基因型进行盆栽干旱试验，通过研究干旱下不同抗旱基因型狗牙根的生长、ROS 及抗氧化系统的响应差异，同时深入分析二者体内与清除ROS 相关的抗氧化酶基因表达水平上的变化差异，旨在为初步揭示新疆狗牙根响应干旱的机制及抗旱材料的选育提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料与培养

以抗旱基因型C138 及不抗旱基因型C32 为代表，于2019 年6-8 月在新疆农业大学室外进行培养及处理，平均温度为18.0~28.2 ℃，将直径为15 cm，土层深度为5 cm 的草皮分至大小、体积基本一致，移栽至内装0.9 kg 混土（花土∶基质土∶黄沙=2V∶2V∶1V）的塑料花盆中（直径8 cm，深15 cm），每个盆下有一个塑料板，以收集额外的水。在建坪期间，植物每周被修剪到10 cm，每3 d 浇水一次，每周用半强度的Hoagland 溶液施肥，促进生长，待苗覆盖度达到95%时（50 d），对其进行干旱胁迫。

1.2 干旱胁迫处理

50 d 后（2019 年8 月2 日），在室外条件下，对试验材料实施2 种处理：1）水分充足的控制处理（CK）：植物每2 d 浇水一次，以保持土壤含水量（water content of soil，SWC）在30%左右；2）干旱胁迫处理（D）：在C138 和C32 干旱7 d 后，SWC 下降到4%；为了更快地确定每个盆的土壤含水量，减少试验误差，每2 d 使用土壤水分传感器（MP-508B，中国）对每一盆直接测定土壤水分，在顶部20 cm 土壤剖面中垂直插入20 cm 长的波导探头，记录土壤体积含水量（soil volumetric moisture content，VWC），干旱0、7 及复水2 d 后随机选择10 盆使用铝盒环刀取样，迅速称取鲜重（fresh weight，FW），后烘干（105 ℃，48 h）称干重（dry weight，DW），计算土壤含水量，公式为SWC（%）=（FW-DW）/DW×100。通过SWC 与VWC 的线性回归方程y=1.0333x+1.116（R2=0.989）计算干旱3 及5 d 时的土壤含水量。

每个材料的每种处理都有4 个重复（4 个盆栽），并被安排在一个完全随机的设计中。在试验处理之前，将每盆缓慢浇至水从底部排水孔中流出，干旱0、3、5、7 d 及复水第2 天的早上8：00 取样测定草坪质量、VWC、相对含水量（relative water content，RWC）、叶绿素含量（chlorophyll content，Chl）、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、O2·-和H2O2含量，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxiredoxin，POD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性及相对电导率（electrical conductivity，EL）。

1.3 生理参数测定

参照美国国家草坪草评价体系（national turfgrass evaluation program，NTEP）评价标准［19］测定草坪质量，使用Hu 等［20］描述的方法测定狗牙根叶片相对电导率、叶片相对含水量。叶绿素含量参照Sartory 等［21］的方法，用95%的乙醇提取叶绿素。

用MDA 含量来表征脂质过氧化，MDA 含量测定参照Wang 等［22］的方法，称取0.1 g 叶片，用液氮磨成粉末，加10 mL 的三氯乙酸（5% TCA，w/v）研磨成匀浆，于10000 r·min-1在4 ℃下条件下离心15 min，吸取2 mL 上清液加入2 mL0.5%的硫代巴比妥酸溶液（对照用2 mL 蒸馏水），混匀，沸水加热30 min，立即用冰浴冷却，再次离心，取上清液在532、450 和600 nm 波长下读取吸光度值。

酶液的提取：用5 mL 50 mmol·L-1的磷酸盐缓冲提取液（phosphate buffer saline，PBS）（PH 7.8），内含5 mmol·L-1乙 二 胺 四 乙 酸 二钠，2 mmol·L-1抗 坏 血 酸（ascorbic acid，AsA），2% 聚 乙 烯 吡 咯 烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP），冰浴研磨0.5 g 叶片组织样品，研磨至匀浆后于12000 r·min-1离心10 min，上清液即为测定液，用于SOD、POD、CAT、APX 活性测定。将上清液分为3 管备用，所有提取物均在0~4 ℃条件下制备，并在25 ℃处进行测量［23］。SOD 活性是根据Giannopolitis 等［24］的方法在560 nm 波长下测定吸光值，并稍加调整，调整为3 mL 的反应体系，其中2.8 mL 反应混合液为50 mmol·L-1PBS（pH=7.8），内含0.1 mmol·L-1乙二胺四乙酸，13 mmol·L-1甲硫氨酸和75 μmol·L-1氯化硝基四氮唑蓝（nitrotetrazolium blue chloride，NBT），0.1 mL 的60 μmol·L-1核黄素溶液和0.1 mL 的酶液，以用非酶溶液作为对照。在200 mmol·m-2·s-1辐照度下照射反应混合物20 min。用分光光度计监测560 nm 处的吸光度变化3 min。一个单位的SOD 活性定义为抑制NBT 降低50%所需的酶量。用愈创木酚显色法［25］测定POD 活性，并稍加调整，调整为3 mL 的反应体系，包括1 mL 的H2O2（0.3%）、0.95 mL 的愈创木酚（0.2%）和0.1 mL 酶液，于470 nm 下测定1 min 内吸光度的变化值。用紫外吸收法测定CAT 活性［26］，并稍加调整，调整为3 mL 的反应体系，包括2.8 mL 50 mmol·L-1PBS（内含45 mmol·L-1H2O2，pH7.0），0.2 mL 酶液，于240 nm 波长下测定吸光值，持续3 min。一个单位的CAT 活性定义为0.01 单位·min-1的吸 光 度变 化。参考Nakano 等［27］的方 法 测定APX 活 性。3 mL 的 反 应 体 系，包 含：50 mmol·L-1的PBS（pH 7.0）、0.1 mmol·L-1的EDTA，0.5 mmol·L-1的AsA、0.1 mmol·L-1H2O2和0.2 mL 酶液。在290 nm 下测定1 min 内的变化值，测定反应在290 nm 处的吸光度1 min，根据AsA 的下降速率计算APX 的活性。

H2O2及O2·-含量参照南京建成试剂盒（南京建城生物工程研究所，中国）说明书的方法进行测定。

1.4 抗氧化酶系统相关基因的表达

使用TransZolUp Plus RNA Kit（TransGenBiotech，北京，中国）试剂盒提取狗牙根总RNA，RNA 的纯度、浓度采用Nanodrop 2000（Wilmington，DE，美国）检测，同时用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测完整性。使用ABM逆转录试剂盒（Applied Biosystems，Burlington，加拿大）将高质量的样品RNA 反转录为cDNA，详细步骤参照说明书，反应条件：37 ℃，120 min；85 ℃，5 min。反应结束后，保存于-20 ℃。以肌动蛋白Actin 基因（Actin）为内参，SOD、POD、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）、脱氢抗坏血酸还原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）基因序列来自吕爱敏等［28］，CAT和APX基因序列来自Bian 等［29］。共8 条基因序列，应用Primer 5.0 设计引物（表1），用1.5%琼脂糖凝胶验证引物的特异性及扩增产物的大小，用凝胶成像仪（UVP Biodoc-IT 220）照胶。使用ABM Eva Green 试剂进行qRT-PCR（Mastercycler ep realplex2荧光定量PCR 仪），反应条件：94 ℃2 min ，94 ℃15 s，58 ℃15 s，68 ℃30 s，40 次循环。定量表达结果依据CT 数值，根据2-∆∆Ct法［30］，分别计算目标基因在不同处理下的相对表达量。

表1 实时荧光定量引物信息Table 1 Real-time fluorescence quantitative primer information

1.5 数据分析

所有数据在分析前必须满足正态分布和方差齐性，以符合单因素方差分析（ANOVA）的要求，利用Microsoft Excel 2013 进行数据整理，采用SPSS 19.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，美国）进行相关数据的统计分析，采用Fisher 最小显著性差异法（LSD）检验不同处理间的差异（P<0.05）。利用SigmaPlot 10.0（Systat Software Inc.，Chicago，IL，美国）软件作图。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对草坪质量的影响

本试验过程中，土壤含水量维持在3.2%~30.0%（图1B），干旱过程中2 个基因型的土壤含水量无显著性差异，说明C138 和C32 的根系处于同一土壤水分亏缺水平，且干旱下2 个基因型的土壤含水量及草坪质量（图1C）随着干旱时间的增长显著降低。且C32 的草坪质量比C138 下降更快，干旱至第7 天时，C32 的草坪质量为2.9（低于C138），复水后C138 的草坪质量较C32 恢复更好（图1A，C）。这也表明，C138 与C32 相比具有较好的耐旱性和抗旱恢复潜力。

图1 在干旱胁迫和非胁迫条件下，两种不同的耐旱狗牙根基因型的表型（A）、土壤水分（B）和草坪质量（C）的变化Fig. 1 Change in the phenotypes （A），soil water content （B） and turf quality （C） of two different drought tolerant bermudagrass genotypes under stressed and non-stressed conditions

2.2 干旱胁迫对狗牙根膜透性及氧化产物的影响

干旱胁迫降低了干旱组2 个基因型的叶片RWC 和Chl，增加了叶片EL。在干旱胁迫条件下，两个基因型的叶片RWC、EL 和Chl 与对照相比在第5 和7 天均有显著性差异，干旱处理第5 和7 天时，C32 叶片EL 急剧上升，RWC、Chl 均急剧下降，且C32 较C138 下降或上升更快。干旱至第7 天时，C138 的RWC 和Chl 下降至58.53%和1.42 mg·g-1（高于C32），EL 升高至61.88%（低于C32）。复水后，C138 和C32 的EL、RWC 和Chl 均有一定程度恢复，但C32 并未恢复到原来水平（图2）。

对照组O2·-、H2O2和MDA 含量在处理前后无明显变化，与对照组相比，干旱组2 个狗牙根基因型的O2·-、H2O2和MDA 随干旱胁迫时间的增长而积累，复水后均降低（图2）。干旱3 d 后，干旱组C32 的O2·-和H2O2含量的升幅高于C138，干旱第7 天时，C138 和C32 的O2·-分别较对照增加了33.2%和50.4%（图2）。复水后，2 个基因型的O2·-及H2O2含量均与对照无明显差异。干旱胁迫至第3 天时，干旱组C138 与C32 的MDA 含量无明显变化，胁迫至第5 和7 天时，C32 的MDA 含量均显著高于C138（P<0.05），且干旱胁迫至第7 天时，C138 与C32 的MDA含量均增至最高值，分别较对照组增加了39.2%和56.5%。复水后，C32 的MDA 含量明显高于C138。

图2 干旱胁迫下狗牙根膜透性及氧化产物的变化Fig.2 Changes of bermudagrass membrane permeability and oxidation products under drought stress

2.3 干旱胁迫对狗牙根抗氧化酶活性的影响

对照组2 种基因型狗牙根的SOD、POD、CAT 和APX 活性随干旱时间增长变化不显著，随着胁迫时间的延长，干旱组2 个基因型的SOD、POD、CAT 的活性均先升高后降低，而C138 的APX 活性则持续升高（图3）。2 个基因型的SOD、POD 和CAT 活性均在胁迫5 d 达到峰值，第7 天显著下降。胁迫至第5 天时，干旱组基因型中C32 的APX 活性增加至峰值，达21.31 U·g-1FW，较对照组增加了38.23%，胁迫至第7 天时，C138 的APX 活性增加至峰值，且C138 的POD 及APX 活性较对照增加了48.82%和46.23%（高于C32），而C32 的CAT 活性显著低于对照（P<0.05）。复水后，各处理及基因型间SOD、CAT 和APX 活性差异不显著，干旱组狗牙根基因型的POD 活性均显著高于对照组（P<0.05）。

图3 干旱胁迫下狗牙根抗氧化酶活性的变化Fig.3 Changes of antioxidant enzyme activities of bermudagrass under drought stress

2.4 干旱胁迫对狗牙根抗氧化系统相关基因的影响

随着干旱胁迫时间的延长，2 个狗牙根基因型叶片的SOD，CAT，APX，DHAR的表达水平随干旱的加剧均先上升后下降（图4），干旱胁迫至第5 天时，C138 的SOD，CAT及APX、DHAR基因表达水平达到峰值，达2.0、3.3、7.1 和2.4（高于C32），而C32 的CAT、APX及DHAR基因表达水平较第3 天均下降。干旱诱导了2 个狗牙根基因型POD和GPX基因的上调表达，并且随着干旱的加剧，其表达水平均逐渐上升，但两者的上调表达幅度不同，其中在干旱第3 及7 天时，C138 较C32 分别高出66.7%及95.6%（P<0.05），复水后，抗旱型C138 的POD和GPX基因表达水平显著高于不抗旱型C32（P<0.05）。

图4 干旱胁迫下狗牙根抗氧化酶基因的表达变化Fig.4 Changes of antioxidant enzyme gene expression in bermudagrass under drought stress

3 讨论

与先前41 份狗牙根材料抗旱性鉴定结果一致［18］，本研究发现，随着土壤含水量的下降，抗旱型C138 在干旱至第7 天时的草坪质量、RWC 及叶绿素含量下降程度较不抗旱型C32 低，表明耐旱的植物能够保持足够的水分状态和生理活性以适应干旱。此外，干旱胁迫能造成ROS（H2O2、·OH-、O2·-和HO-）大量积累，引起植物细胞损伤及脂质过氧化［31］。EL 是公认的鉴定植物细胞膜稳定性或细胞损伤程度的指标［32］，MDA 含量可以反映脂质过氧化程度［33］。本研究发现，干旱胁迫显著提高了干旱组狗牙根叶片EL、MDA 和ROS（H2O2和O2·-）含量，其中抗旱型C138 提高程度低于不抗旱型C32。这与在多年生黑麦草（Lolium perenne）［34］和禾本科作物水稻（Oryza sativa）［11］中发现的结果一致，干旱胁迫增加了脂质过氧化物的含量。抗旱型植物具有较为完整而稳定的细胞膜，这可能与较少的MDA 和ROS（H2O2和O2·-）的积累及更强的抗氧化防御能力有关［35］。

Huang 等［13］报道了植物在干旱胁迫下有自己的清除ROS 策略，包括SOD、CAT 和APX 等［10］。在本研究中，短期干旱胁迫（第3 天）显著诱导抗氧化酶的活性，包括SOD，POD，CAT 和APX，这表明抗氧化酶可能是保护狗牙 根 免 受 干 旱 胁 迫 的 部 分 原 因。Bi 等［36］在 高 羊 茅（Festucaspp.）及Fu 等［37］和Xu 等［14］在 草 地 早 熟 禾（Poa pratensis）中发现，当受到重度干旱胁迫时其抗氧化酶系统会受到损伤并导致SOD、POD 和CAT 活性急剧下降。本试验中干旱后期（第5 天以后），SOD，POD，CAT 活性均下降，且对C32 影响更明显，表明抗旱型C138 对ROS的清除能力强于不抗旱型C32。Fu 等［37］和Xu 等［14］也发现干旱胁迫下不抗旱草地早熟禾品种的抗氧化酶活性的降幅最大。APX 是清除叶绿体中AsA-GSH 循环所产生的H2O2和催化AsA 氧化的关键酶［38］。本研究中抗旱型C138 的APX 的活性显著增加，不抗旱型C32 的APX 活性先增加至第5 天以后开始下降，两个材料随干旱胁迫的加剧其反应并不一致，表明不同耐旱性植物在干旱胁迫条件下呈不同的同工酶模式［39-40］。同时也表明了APX 活性与植物的抗旱性正相关［14，41］。

对干旱及复水后的基因表达及抗氧化酶活性变化的研究可以为植物对干旱胁迫的分子适应提供深入的了解［14］。Shi 等［42］发现ROS 清除相关基因（SOD、POD、CAT）的诱导表达和抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性的提高，可以清除渗透胁迫产生的过量ROS，增强了细胞的抗氧化能力，有利于植物适应干旱胁迫。本研究表明，胁迫第3 天时，抗旱型C138 的SOD、POD、CAT、APX、DHAR和GPX的表达水平均显著高于不抗旱型C32，且抗旱型C138 的SOD，POD 和APX 活性与C32 无显著差异，但在干旱至第5 天时有显著差异，表明干旱下抗氧化酶活性与其基因表达水平对干旱的响应时间并不一致，且两者存在差异，这些差异可能由于其他未知因素参与控制抗氧化基因的转录水平，也可能是干旱胁迫改变了转录后调控中的如酶降解或失活等过程。同样，干旱下草地早熟禾［14］和野生大麦（Hordeum vulgare）［43］的抗氧化酶活性与其基因表达水平之间存在差异。本研究中干旱下供试狗牙根的POD和GPX基因表达水平在胁迫0~7 d 时一直呈上升趋势，复水后恢复，说明POD和GPX基因参与了植物抗旱信号传导过程，减少干旱给狗牙根带来的氧化损伤；结合抗氧化酶活性，复水后抗旱型C138 的POD 活性和POD基因表达水平显著高于不抗旱型C32，这与Ji 等［44］的研究结果一致，说明POD 在复水过程中对提高抗氧化能力及持续清除ROS 起着至关重要的作用。

4 结论

干旱胁迫影响了狗牙根叶片水分含量及细胞膜透性，表现为叶片相对含水量显著下降，相对电导率显著升高。干旱胁迫下，在不抗旱型C32 中叶片相对含水量及叶绿素含量下降较快，两个基因型狗牙根叶片的O2·-、H2O2及MDA 含量均显著上升，且C32 升高更显著；但抗氧化酶活性对干旱的响应并不一致，SOD、POD 与CAT活性呈先升后降趋势，而APX 活性持续增加，表明SOD、POD 与CAT 在干旱前期首先响应，APX 在干旱胁迫后期响应。在长期胁迫下，抗旱型C138 对比不抗旱材料表现为具有高的SOD、POD、CAT 及APX 活性以及高的SOD、POD、CAT、APX、DHAR和GPX基因表达水平，而不抗旱型C32 表现出高的脂质过氧化和最低的抗氧化酶活性和基因表达；在复水过程中，POD 活性对于提高抗氧化能力及清除ROS 有着至关重要的作用。总之，干旱胁迫诱导抗氧化酶活性升高及其相关基因上调表达，增强了细胞内的抗氧化防御能力，有助于狗牙根维持细胞膜稳定性，延缓叶片的脱水，从而提高了狗牙根的抗旱能力。