高效液相色谱法测定香肠中脱氢乙酸的不确定度评定

孙爱玲，刘 叶

（壹诺（天津）检测服务有限公司，天津 300383）

脱氢乙酸，一种典型的防腐化学药品，对霉菌及酵母菌具有很强的抑制作用，是我国食品防腐行业不可缺少的重要化学品之一。尽管脱氢乙酸毒性低，但是短时间内过量服用还是有一定风险，会对人们的中枢神经和肝肾造成伤害，在严重的情况下甚至可能具有一定的致癌风险[1]。所以，对脱氢乙酸的监督管理和日常检测也是至关重要的。我国《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）中对此进行了严格的规定，在熟肉制品中脱氢乙酸的使用量最大不可超过0.5 g/kg（以脱氢乙酸计）。对不确定度进行评估是衡量检验结果是否准确的重要指标，在很大程度上体现了测定结果的可信度以及实验室的检测水平[2]。本文主要以《食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定》（GB 5009.121—2016）[3]为依据，使用其中的第二种方法，对火腿中脱氢乙酸含量进行测试，并对结果进行不确定评估。通过对不确定度来源及影响因素的论述，为结果的准确性提供依据，并为未来的相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪：安捷伦1260（紫外检测器）。

脱 氢 乙 酸 标 准 物：N-11578-1G，CHEM SERVICE；甲醇、乙酸铵：Fisher Chemical，色谱纯；硫酸锌、氢氧化钠：分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2 实验方法

根据GB 5009.121—2016 中所涉及的第二种方法对进行样品前处理。首先准确称取均匀样品2.5 g，将其加入50 mL 离心管。再加入5 mL 硫酸锌（120 g/L）、10 mL H2O， 用20 g/L NaOH 调节溶液pH 值为7.5。然后，准备一个25 mL 的容量瓶，并将上述混合溶液转移至其中。再加入溶剂至刻度完成定容后，将混合液在超声波机中进行超声10 min，以使其进一步均匀混合。然后，使用一次性吸管将该混合溶液转移到分液漏斗中，并且在其中加入10 mL 的正己烷，摇匀此溶液后将其静置。静置过后的溶液分为两层，丢弃上层正己烷层，并且在分液漏斗中再次添加10 mL 的正己烷溶液，再一次重复上述操作以得到较好的效果。最后，取出下层的水相溶液，将其置于提前准备好的干净的离心管中进行离心10 min。然后在0.45 μm 滤膜上过滤上清液，并将其放在一旁备用。

1.3 液相色谱检测条件

色谱柱：ODS-3 C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.02 mol/L 乙酸铵（10 ∶90）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：293 nm。

1.4 标准曲线的配制

在烧杯中准确称取0.05 g 脱氢乙酸标准品，在此标准品中加入5 mL NaOH（20 g/L）溶液，搅拌使其充分溶解，并将溶解后的溶液转移至50 mL 容量瓶，加入适量的水将其进行定容后便可以得到后续实验所需要的标准储备液，其浓度为1 000 μg/mL。然后，分别移取储备液0.01 mL、0.10 mL、0.50 mL、1.00 mL 和2.00 mL 于10 mL 容量瓶，按照操作规程加溶剂到所需要的刻度进行定容。定容后将溶液进行摇晃混合均匀，并将其配制成标准溶液以待下一步的测定。

1.5 数学模型

测量结果计算公式如下：

式中：X为脱氢乙酸的含量，g/kg；m为样品质量，g；C1为脱氢乙酸的浓度，μg/mL；C0为空白样品的脱氢乙酸浓度，μg/mL；V为定容体积，mL。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源分析

根据笔者所建立的数学模型可以知道，结果的不确定性来源主要包括药品的称量、溶液的定容、标准工作曲线溶液的配制与曲线拟合、仪器的精密度以及样品的重复性测定。

2.2 样品称量导致的不确定度

（1）将样品称样两次，天平的最大允差为±0.000 1 g，区间半宽度为0.000 1 g，按均匀分布,那么由天平误差引入的不确定度为：

（2）所用天平的分辨率为0.000 1 g，区间半宽度为0.000 05 g，按均匀分布，那么由天平分辨率引入的不确定度为：

则样品称量引入的合成不确定度为u(m)==8.7×10−5g，相对标准不确定度为=3.5×10−5。

2.3 样液定容导致的不确定度

本研究中所使用的25 mL 的容量瓶所具有的最大允差是±0.03 mL， 按照均匀分布，则由容量瓶引入的相对不确定度为u(V25mL)==0.017。

实验室的温度为（20±5）℃，温度的波动会影响容量瓶和溶剂的体积。20 ℃时容量瓶的膨胀系数为2.5×10-5/℃，远小于水的膨胀系数2.1×10-4/℃，因此可忽略容量瓶的体积变化，按均匀分布，则由温度变化引入的不确定度为：

则样液定容时的合成不确定度为u(V)==0.023 mL，相对标准不确定度为=9.2 ×10−4。

2.4 标准溶液配制产生的不确定度

2.4.1 标准物质引入的不确定度

根据证书，脱氢乙酸（99.5%）的相对标准不确定度为±0.5%，包含因子k=2， 则urel(c')==0.002 5。

2.4.2 标准工作液配制产生的不确定度

（1）移液器引入的不确定度。依据计量证书提供的数据，按均匀分布，计算各移液器引入的相对不确定度如表1 所示。

表1 移液器引入的相对标准不确定度

移液器引入的合成相对标准不确定度为：

（2）容量瓶引入的不确定度。根据器材台账，本论文所使用的10 mL 容量瓶允差是±0.02 mL，50 mL 容量瓶允差是±0.05 mL,按均匀分布，则容量瓶引入的相对不确定度为urel(V10mL)==0.001 2，urel(V50mL)==0.000 58。

20 ℃时水的膨胀系数2.1×10-4/℃，温度（20±5）℃，按均匀分布，则u=00..000000 6611。

则标准溶液定容时，10 mL 和50 mL 容量瓶引入的合成相对不确定度分别为：

标准溶液配制过程中容量瓶引入的合成相对不确定度为：

因此，合成标准物质配制产生的相对不确定度为：

2.4.3 标样称量引入的不确定度

则标样称量导致的合成不确定度为：

相对标准不确定度为：

因此，标准工作溶液引入的相对标准不确定度为：

2.5 仪器定量引入的不确定度

样品进样量为10 μL，查得高效液相色谱的允许误差为6.3%， 按均匀分布， 则urel(q)==0.003 6。

2.6 标准工作曲线拟合引入的标准不确定度

工作液浓度为1 mg/L、10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L 和200 mg/L 时，峰面积Y分别为7.068、70.068、345.800、711.150 和1 381.900。曲线回归方程为Y=6.9483 4X，R=0.999 94。

标准曲线拟合引入的标准不确定度计算公式如下：

式中：S(Y)为标准曲线的标准差；P为样品溶液的测定次数；N为标准溶液的测定次数；b为标准曲线的斜率；cx为样品溶液中待测物的浓度，mg/L；为标准溶液浓度的平均值，mg/L；ci为标准溶液的浓度，mg/L；Yi为单次标准溶液的响应值。

2.7 样品测定重复性引入的不确定度

对香肠中脱氢乙酸含量进行10 次重复测定，根据计算公式得出结果分别为0.151 g/kg、0.151 g/kg、0.156 g/kg、0.155 g/kg、0.154 g/kg、0.155 g/kg、0.154 g/kg、0.152 g/kg、0.156 g/kg 和0.150 g/kg。

2.8 合成不确定度

将上述各分量合成相对标准不确定度为：

合成标准不确定度为：

u(Y)=0.153×0.103=0.016 g/kg

2.9 扩展不确定度及测定结果报告

95%置信概率下取包含因子k=2，将合成标准不确定度乘以包含因子计算得到脱氢乙酸测量结果的扩展不确定度为U=u(Y)×k=0.032 g/kg。

因此可以得出结论，香肠中脱氢乙酸的含量是（0.153±0.032）g/kg，k=2。

3 结论

本文以国家标准文件为理论依据，使用液相色谱法对香肠中所含有的脱氢乙酸含量进行了准确的测量。与此同时，对测定结果可能出现的不确定度来源的主要因素进行了合理的考察，并基于数学模型进行了准确计算。研究发现，标准溶液的配制、曲线的拟合和样品的重复测定是影响结果不确定度的主要因素，样品前处理过程中的称量、定容对不确定度的影响较小。因此，实验中要严格遵守操作规程，使用有证标准物质，对仪器设备进行定期检定和期间核查，提升专业人员的技术水平，是提高检测结果准确性的前提。