蛋白酶体抑制剂RA190对口腔腺样囊性癌的调节作用*

赵曦，郑黎薇，周丹，王春

[1.德阳市人民医院口腔科，四川德阳 618000；2.四川大学华西口腔医院（口腔疾病研究国家重点实验室），四川成都 610041；3.德阳市人民医院麻醉科，四川德阳 618000]

口腔腺样囊性癌主要发生在唾液腺，约占所有唾液腺恶性肿瘤的22%。临床资料分析表明，口腔腺样囊性癌治疗后10年生存率约为29%～40%，唾液腺样囊性癌死亡的主要原因是局部复发和远处转移[1-2]。因此本研究寻找口腔腺样囊性癌新的治疗靶点，为有效的治疗方案提供参考依据。 泛素- 蛋白酶体通路（ubiquitin-proteasome pathway, UPS）是非细胞内溶酶体，参与多个细胞通路相关基因蛋白的降解，调节细胞凋亡、细胞周期等生理过程[3-5]。非ATP 酶依赖性调节颗粒13（regulatory particle non-ATPase 13, Rpn13）是蛋白酶体19 S 亚单位上的泛素受体，而双苄基吡啶酮（RA190）是一种新的蛋白酶体抑制剂。目前尚未有关于Rpn13、RA190 与口腔腺样囊性癌作用的相关研究，因此，本研究通过观察RA190 对ACC-2细胞增殖、凋亡及Survivin、TIP30、泛素化蛋白表达的影响，探讨RA190 是否可能通过Rpn13 抑制蛋白酶体的功能，起到抗口腔腺样囊性癌的作用及其可能机制，为其进行临床应用提供实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

右腭小唾液腺腺样囊性癌ACC-2 细胞、唾液腺上皮细胞（中国科学院上海生命科学研究院）。10%小牛血清（美国Invitrogen 公司），DMEM 培养基（美国Gibco 公司），100 μL/mL 抗生素（美国HyClone 公司），胰蛋白酶（美国Gibco 公司），opti-MEM 低血清培养基（美国Invitrogen 公司），lipofectamineTM2000（美国Invitrogen 公司），siRNA（中国Ribo Bio 公司），RA190（美国San Diego 公司），MTT 试剂盒（美国Sigma-Aldrich 公司），逆转录试剂盒（加拿大Fermentas 公司），PCR 混合试剂、Trizol（美国Invitrogen 公司），预染蛋白质分子量标准（Marker）（美国Bio-Rad 公司），NC 膜（美国GE 公司），SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒（美国Sigma公司），抗β -actin、抗Rpn13、抗ubiquitin、抗survivin、抗TIP30（美国Cell Signaling 公司）。

SW-CJ-2FD 型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），细胞培养盘（美国BD FALCAN 公司），15AC 型二氧化碳培养箱（日本SANYO 公司），TS-2 脱色摇床、漩涡混合器（中国其林贝尔有限公司），IMS-40 制冰机（中国雪科有限公司），HQ-320XT 医用胶片冲洗机（中国虎丘影像科技有限公司），MyiQ thermocycler（美国Bio-Rad 公司），紫外分光光度计（日本岛津公司），BSA124S型电子天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司），5418 型离心机（德国Eppendorf 公司），全自动酶标仪、SDS-PAGE 凝胶电泳设备（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养ACC-2 细胞用DMEM 培养基在37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，当细胞密度达到80%的时候，传代分盘备用。

1.2.2 干扰ACC-2 细胞中Rpn13 的表达通过LipofectamineTM2000 作为转染剂敲除Rpn13，通过多次的条件摸索优化得到最优的细胞密度及质粒，选择最有效的敲除序列和浓度。在干扰Rpn13基因表达时，设计了S1、S2、S3 序列，经多次试验，选用细胞浓度为60%，siRNA 为S2 序列，浓度为10 μL/mL。

1.2.3 RA190 处理ACC-2 细胞为确定RA190 是否能有效地抑制ACC-2 的细胞生长，用4 种不同剂量（分别为400 nmol/L、500 nmol/L、600 nmol/L 和700 nmol/L）的RA190 处理A 组细胞，处理48 h 后，MTT 法观察各组细胞增殖、凋亡情况。

1.2.4 实验分组ACC-2 细胞通过不同方法处理后，分为ACC-2 组、ACC-2-Rpn13-siRNA 组（通过敲除来改变ACC-2 细胞中Rpn13 的表达）、RA190-ACC-2 组（用RA190 处理ACC-2 细胞）、RA190-ACC-2-Rpn13-siRNA 组（用RA190 处理ACC-2-Rpn13-siRNA 细胞）。

1.2.5 MTT法检测细胞增殖、凋亡取4 组对数生长期细胞接种于24 孔培养板内，每孔细胞数为2×104个/mL，每组细胞设6 个复孔，每孔加入500 μL 的1 mg/mL MTT 工作液，在培养箱中放置3 h，吸取上清液，再在每孔中加入500 μL 0.4%酸化异丙醇（0.04 mol/L HCL），摇床震荡后，每孔吸取200 μL 至96 孔酶标板中，用全自动酶标仪检测570 nm 波长处的光密度（OD）值。

1.2.6 Western blotting 检测Rpn13、Survivin、TIP30、泛素化蛋白的表达处理后的细胞培养24 h，提取4 组细胞的蛋白，Western blotting 检测Rpn13、Survivin、TIP30、泛素化蛋白的表达，用Quantity One Vesion 4.5.0 软件分析结果图像的灰度值。

1.2.7 qRT-PCR 检测Survivin 和TIP30 mRNA 相对表达量取对数生长期密度为1×106个/mL 的细胞各2 mL 接种于6 孔培养板，培养24 h，采用Trizol法提取各组细胞总RNA，每组取总RNA 模板建立20 μL 逆转录反应体系：10 μL 2×qPCR Mix；0.5 μL Forward Primer（10 μmol/L）；0.5 μL Reverse Primer（10 μmol/L）；2.0μL cDNA；加ddH2O 至20 μL。反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 min，58℃退火30 min，72℃延伸20 min，共42 个循环，95℃保温10 min。计算目的基因和β-actin 相对表达量（2-ΔΔCt）。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ACC-2 组细胞与ACC-2-Rpn13-siRNA 组Rpn13蛋白相对表达量的比较

对ACC-2 细胞进行siRNA 转染后，ACC-2 组Rpn13 蛋白相对表达量为（0.942±0.053），ACC-2-Rpn13-siRNA 组Rpn13 蛋白相对表达量为（0.217±0.037），两者比较，差异有统计学意义（t=0.786，P=0.000），ACC-2-Rpn13-siRNA 组Rpn13 蛋白相对表达量较ACC-2 细胞组降低。见图1。

图1 ACC-2细胞组和ACC-2-Rpn13-siRNA组Rpn13蛋白的表达

2.2 不同剂量RA190作用ACC-2细胞后OD值的比较

MTT 法检测结果显示，不同剂量的RA190 作用ACC-2 细胞后OD 值比较，差异有统计学意义（P<0.05），随着RA190 剂量增加，OD 值下降，RA190剂量达到600 nmol/L 后，OD 值下降趋于稳定，因此本实验选择RA190 的剂量为600 nmol/L。见表2和图2。

表2 不同剂量RA190作用ACC-2细胞后OD值的比较 （±s）

表2 不同剂量RA190作用ACC-2细胞后OD值的比较 （±s）

注：†与0 nmol/L组比较，P<0.05。

组别0 nmol/L组400 nmol/L组500 nmol/L组600 nmol/L组700 nmol/L组F 值P 值OD值0.746±0.004 0.625±0.006†0.523±0.007†0.347±0.006†0.331±0.008†2.520 0.000

图2 不同剂量RA190作用ACC-2细胞后的OD值比较（±s）

2.4 各组细胞OD值比较

MTT 法检测结果显示，各组ACC-2 细胞OD值比较，差异有统计学意义（P<0.05）。相较于ACC-2组，其他3 组的OD 值均降低。见表3和图3。

图3 4组细胞的OD值比较 （±s）

表3 各组细胞的OD值比较 （±s）

表3 各组细胞的OD值比较 （±s）

注：†与ACC-2细胞组比较，P<0.05。

组别ACC-2组ACC-2-Rpn13-siRNA组RA190-ACC-2组RA190-ACC-2-Rpn13-siRNA组F 值P 值OD值0.776±0.031 0.610±0.027†0.366±0.031†0.536±0.035†89.220 0.000

2.5 各组Survivin、TIP30、泛素化蛋白相对表达量的比较

各组Survivin 蛋白、TIP30 蛋白、泛素化蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（P<0.05），与ACC-2 组比较，其余3 组Survivin 蛋白相对表达量均降低（P<0.05），TIP30 蛋白、泛素化蛋白相对表达量均升高（P<0.05），RA190-ACC-2 组TIP30 蛋白相对表达量最高，泛素化蛋白聚集最明显，其余两组与ACC-2 组比较也有差异，但增加幅度小于RA190-ACC-2 组。见图4和表4。

图4 Survivin、TIP30、泛素化蛋白的表达

表4 各组Survivin、TIP30、泛素化蛋白相对表达量比较（±s）

表4 各组Survivin、TIP30、泛素化蛋白相对表达量比较（±s）

注：†与ACC-2细胞组比较，P<0.05。

组别ACC-2组ACC-2-Rpn13-siRNA组RA190-ACC-2组RA190-ACC-2-Rpn13-siRNA组F 值P 值Survivin蛋白1.051±0.047 TIP30蛋白0.873±0.119泛素化蛋白1.133±0.158 0.846±0.047†3.546±0.140†2.431±0.207†0.109±0.026†7.205±0.093†4.053±0.256†0.993±0.064†5.354±0.217†1.956±0.196†105.600 0.000 249.200 0.000 974.900 0.000

2.6 各组Survivin 和TIP30 mRNA 相对表达量的比较

各组Survivin mRNA 相对表达量比较，差异有统计学意义（P<0.05），与ACC-2 组比较，其余3 组Survivin mRNA 相对表达量均降低（P<0.05），RA190-ACC-2 组Survivin mRNA 相对表达量最低。各组TIP30 mRNA 相对表达量比较，差异有统计学意义（P<0.05），与ACC-2 组比较，其余3 组TIP30 mRNA 相对表达量均升高（P<0.05），RA190-ACC-2 组TIP30 mRNA 相对表达量最高。见表5和图5。

表5 各组Survivin和TIP30 mRNA相对表达量的比较 （±s）

表5 各组Survivin和TIP30 mRNA相对表达量的比较 （±s）

注：†与ACC-2组比较，P<0.05。

组别ACC-2组ACC-2-Rpn13-siRNA组RA190-ACC-2组RA190-ACC-2-Rpn13-siRNA组F 值P 值TIP30 mRNA 1.000±0.021 1.185±0.031†1.773±0.044†1.276±0.021†345.000 0.000 Survivin mRNA 1.000±0.031 0.907±0.022†0.518±0.028†0.788±0.013†211.300 0.000

图5 各组Survivin mRNA、TIP30 mRNA相对表达量（±s）

3 讨论

研究表明，26 S 蛋白酶体可降解大多数的细胞蛋白，参与DNA 修复、细胞周期调节、细胞凋亡、胞内信号传导等多种生理进程，对维持细胞稳态具有重要意义[6-7]，因此蛋白酶体的降解失调与癌症的发生、发展及治疗相关[8-9]。而26 S 蛋白酶体的组成包括了20 S 核心颗粒和19 S 调节颗粒[10]，其中19 S 调节颗粒上的亚基Rpn13 是泛素识别靶蛋白的重要受体，在识别泛素分子共价结合的靶蛋白后，将蛋白连接到20 S 核心颗粒中进行降解[11-12]，以往研究[13-14]表明，在多种肿瘤细胞中Rpn13 表达水平异常升高，包括卵巢肿瘤、多发性骨髓瘤等，因此认为Rpn13是一种致癌基因。近年来有基因沉默实验也发现Rpn13低表达时会抑制肿瘤细胞增殖，阻断细胞周期，从而使细胞增殖停滞在G0/G1期[15-17]。本研究中RA190 是一种双苄基吡啶酮，在19 S 调节粒子中，RA190 是第一个与Rpn13 相互作用的蛋白酶体抑制剂，与Rpn13 N 端上的PRU 结构域C88 共价结合[18]，RA190 与Rpn13 结合后，抑制了Rpn13 识别泛素化蛋白的作用，从而抑制26 S 蛋白酶体对蛋白质的降解[19-20]。

研究证实通过激活细胞凋亡发挥抗肿瘤活性是肿瘤治疗最重要的途径[21]，可以通过恢复凋亡路径来作为口腔腺样囊性癌靶向治疗的前提，因此本实验将Rpn13 的致癌作用与口腔腺样囊性癌的治疗靶点联系在一起进行研究。结果显示，RA190 通过Rpn13 促进ACC-2 细胞的凋亡，抑制增殖，同时引起泛素化蛋白表达增加，表明RA190 促凋亡的活动主要取决于Rpn13，Rpn13 为口腔腺样囊性癌的致癌基因，可能成为治疗口腔腺样囊性癌的靶点。

本研究还发现，RA190 可以调节癌症治疗重要靶点Survivin 和TIP30 的表达。Survivin 是一种凋亡蛋白抑制因子，其在肿瘤细胞中过度表达，也是多种癌症中肿瘤发生、复发及不良疾病转归的诊断标志物[22-23]，本研究表明RA190 可通过Rpn13 靶向Survivin，诱导癌细胞死亡，可能改善口腔腺样囊性癌的预后。另一种基因TIP30 通过其促凋亡及抗转移和抑制血管生成的能力被认为是一种肿瘤抑制因子，在肺癌、肠癌等癌症中表达下调[24-25]，本实验表明RA190 可通过Rpn13 上调TIP30 的表达来发挥其抑制肿瘤的作用。

本研究证实了RA190 对口腔腺样囊性癌细胞的抑制作用，接下来会进一步探索RA190 对体内癌症的有效性，从而让蛋白酶体抑制剂成为口腔腺样囊性癌患者有效的治疗选择，为治疗口腔腺样囊性癌提供新的途径。