分子对接结合荧光光谱法探究杨梅苷与胰蛋白酶相互作用机理

于 湛, 孙 璐,2, 谷笑雨, 刘珂帆, 刘丽艳, 王晓丹

(1. 沈阳师范大学 化学化工学院, 沈阳 110034;2. 北京师范大学 化学学院, 北京 100875; 3. 朝阳市第一中学, 辽宁 朝阳 122000)

0 引 言

胰蛋白酶(trypsin,Tryp)作为一种重要的蛋白酶,位于人及动物的肠道中[1]。Tryp除了具有消化与分解蛋白质的作用外,还可调控肿瘤细胞生长、分化与增殖[2],在生物、食品工业以及肿瘤研究等领域具有广泛应用[3]。

杨梅苷(myricitrin,MYT)是杨梅素的一种重要糖苷化衍生物[4],其分子结构如图1所示。MYT的天然来源丰富,主要分布在杨梅的果实、树叶、藤茶以及龙眼叶等物质中,MYT具有较强的抗氧化作用,在人体内可有效清除自由基,因此作为药物与保健食品具有良好的应用前景[5]。

图1 杨梅苷的分子结构Fig.1 Molecular structure of MYT

本文研究了Tryp和MYT间的相互作用情况,旨在为了解MYT在体内的吸收、分布以及代谢等提供帮助,并为设计、开发基于MYT的新药提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

主要仪器:荧光光谱仪(Cary Eclipse,Varian,USA)、紫外-可见光谱仪(UH5300,Hitachi,Japan)、pH计(FE20K,Mettler Toledo,USA)、高精度磁力水浴装置(自制)。

主要试剂:MYT(上海阿拉丁公司)、牛胰蛋白酶(Tryp)(美国Amresco公司)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)(美国Sigma-Aldrich公司)、NaCl, HCl, NaOH与无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)、实验用水(超纯水,18.2 MΩ·cm)。

1.2 溶液配制

配制质量浓度为5.0×10-4mol·L-1的MYT乙醇溶液和质量浓度为0.1 mol·L-1, pH值为8.4的Tris-HCl缓冲溶液备用(其中NaCl质量浓度为0.1 mol·L-1),配制1.0×10-3mol·L-1的Tryp储液备用。

在7只5 mL的一次性离心管中分别准确移取200 μL的Tryp溶液以及适量的MYT储液,并加入1 100 μL的Tris-HCl缓冲溶液,随后加水定容至4.0 mL,使得每只离心管中MYT的质量浓度分别为0.0, 2.5×10-6, 5.0×10-6, 7.5×10-6, 1.0×10-5, 1.25×10-5及1.50×10-5mol·L-1。将这些离心管经过涡旋混合20 s后恒温水浴15 min,之后进行荧光测试。

1.3 荧光光谱仪参数

设置荧光光谱仪的λem=280 nm,λ(emslit)=λ(ex slit)=5 nm,扫描范围为280～500 nm;设置同步荧光光谱波长差(Δλ)分别为15与60 nm,扫描范围为200～500 nm。

1.4 分子模拟参数

在RCSB PDB数据库得到Tryp的晶体结构(ID:2PTN),在PubChem网站获得MYT的结构数据。通过AutoDockFR 1.2程序包[6]模拟Tryp与MYT的分子对接过程。将Tryp与MYT分子导入AutoGridFR后,docking box设置为box entire receptor,padding space设置为8.0 Å,grid point space设置为0.375 Å,随后使用内置AutoSite 1.1程序进行主体对接口袋计算,nbRuns与maxEvals采用AutoDockFR的默认值,分别为50与2 500 000。

本文使用Desmond程序[7]进行分子动力学模拟。首先在一个10 Å×10 Å×10 Å的立方体箱子中导入得分最高的分子对接结果,再将立方体箱子中充满TIP3P模型水,选择NPT系综,体系经过2 ns的预平衡后弛豫到指定的压力与温度,最后进行30 ns的分子动力学模拟。

2 结果与讨论

2.1 荧光猝灭

采用式(1)对荧光发射的强度进行校正[8]。

Fcorr=Fobs×e(Aex+Aem)/2

(1)

其中:Fobs与Fcorr为校正前后的荧光强度;Aex为激发波长下Tryp与MYT混合溶液的紫外-可见吸收强度;Aem为发射波长下Tryp与MYT混合溶液的紫外-可见吸收强度。

经过校正,在水浴温度为17 ℃,pH值为8.4的条件下,含有不同质量浓度MYT的5×10-5mol·L-1Tryp溶液的荧光发射光谱如图2(a)所示。由图2(a)可见,Tryp在300～450 nm存在较为明显的荧光发射,最大发射波长位于335 nm处,随着MYT质量浓度的升高,Tryp荧光发射曲线的形状并未改变,但发射强度有所下降,表明MYT对Tryp产生明显的猝灭现象。

图2 (a) MYT在不同质量浓度时Tryp的荧光发射曲线(Tryp质量浓度为5×10-5mol·L-1,MYT质量浓度从1→7分别为0, 2.5×10-6, 5.0×10-6, 7.5×10-6, 1.0×10-5, 1.25×10-5, 1.5×10-5mol·L-1); (b) MYT与Tryp相互作用的Stern-Volmer图Fig.2 (a) Fluorescence curves of Tryp with the existence of various concentrations of MYT(the concentration of Tryp is 5×10-5mol·L-1, the concentration of MYT is 0, 2.5×10-6, 5.0×10-6, 7.5×10-6, 1.0×10-5, 1.25×10-5, 1.50×10-5mol·L-1 from 1 to 7, respective-ly); (b) Stern-Volmer plots for MYT and Tryp

荧光猝灭包括静态猝灭与动态猝灭[9],上述2种类型的猝灭效率均遵循Stern-Volmer方程,为了探究MYT猝灭Tryp的方式,可以通过式(2)对荧光实验数据作进一步分析。

(2)

其中:F0与F分别为MYT加入前后Tryp的荧光强度,为猝灭剂MYT的质量浓度;Ksv为Stern-Volmer方程猝灭常数。如果Stern-Volmer方程猝灭常数Ksv≥2.0×102L·mol-1·s-1,则可认为荧光猝灭为静态猝灭[10]。

图2(b)为温度在17, 27, 37 ℃时Tryp:MYT的F0/F与[Q]的关系图,F0/F对[Q]的线性拟合结果见表1。结果表明,在17, 27, 37 ℃时,Ksv≥2.0×102L·mol-1·s-1,由此可以判断出两者间相互作用机理属于静态猝灭,且Tryp:MYT复合物较为稳定。

Tryp和MYT的结合常数KA与结合位点数n可通过双对数方程(3)[11]获得,所得结果见表1。

(3)

通过表1中的数据可以看出,随着温度的不断上升,Tryp:MYT复合物的KA呈现出升高的趋势。3个温度下的n都约为1,因此,Tryp与MYT以接近1∶1的比例形成复合物,且复合物的组成相对稳定,没有因温度的改变而发生较大的改变。

表1 3种温度下Tryp和MYT相互作用的结合常数Table 1 Binding parameters of the interaction between Tryp and MYT at three temperatures

为了判断Tryp同MYT之间的相互作用力,使用Van’t Hoff方程(4)绘制lnKA与1/T的关系图,热力学常数ΔH,ΔS与ΔG均通过直线的截距和斜率得到[12],计算结果见表2。

(4)

根据已报道的结果[13],热力学常数的符号和大小与结合过程中各种单独的相互作用有着密切的关系。Tryp同MYT之间相互作用的热力学常数ΔH>0,ΔS>0,ΔG<0,因此可见Tryp:MYT复合物为自发形成,且疏水作用在Tryp与MYT结合过程中起到了重要的驱动作用。由于MYT结构中存在很多活泼羟基,所以Tryp同MYT的结合过程也可能受氢键影响。

表2 3种温度下Tryp:MYT复合物的热力学参数Table 2 Thermodynamic parameters of Tryp: MYT complex at three temperatures

2.2 同步荧光光谱分析

同步荧光光谱法可用于研究客体对蛋白质结构的影响,波长差Δλ为15 nm的谱图能够反映出客体对蛋白质Tyr, His, Phe等残基的影响,而Δλ为60 nm的谱图可提供客体单独对蛋白质Trp残基的影响情况[14]。图3是波长差Δλ为15和60 nm的Tryp:MYT复合物的同步荧光光谱。随着MYT的质量浓度从0增加到1.5×10-5mol·L-1,图4(a)与(b)图中Tryp的荧光强度发生较大程度的下降,分别下降了41.86%和42.81%,说明在MYT与Tryp复合后,对Tyr, Phe, His以及Trp残基的影响程度基本相同。

图3 Tryp与不同质量浓度MYT的同步荧光光谱(温度为37℃;pH为8.4;Tryp浓度为5.0×10-5mol·L-1;MYT浓度分别为0, 2.5×10-6, 5.0×10-6, 7.5×10-6, 1.0×10-5, 1.25×10-5及1.5×10-5mol·L-1) (a) Δλ=15nm; (b)Δλ=60nmFig.3 The synchronous fluorescence spectra of Tryp with different concentrations of MYT tem-perature is 37℃; pH is 8.4; tryp concentration is 5.0×10-5mol·L-1; MYT concentration is 0, 2.5×10-6, 5.0×10-6, 7.5×10-6, 1.0×10-5, 1.25×10-5 and 1.50×10-5mol·L-1, respectively) (a) Δλ=15nm; (b) Δλ=60nm

2.3 分子模拟

2.3.1 分子对接

为了进一步了解Tryp对MYT的识别,认识主客体之间的相互作用情况,本文通过Autodock FR程序[6]模拟了主客体之间的分子对接[15],图4给出了得分最高的分子对接结果。由图4可见,MYT结合在Tryp表面,主客体之间存在多个氢键及疏水作用,MYT与Tryp的Tyr39,His40及Ile73等残基之间存在显著的疏水作用,同时,MYT还与Asn34, Asn74, Trp141, Pro152等氨基酸残基存在氢键作用。

图4 MYT与Tryp相关残基的氢键(实线)和疏水作用(虚线)Fig.4 Hydrogen bonds (solid lines) and hydrophobic (dashed lines) interactions of MYT with pertinent residues of Tryp

图5 MYT与Tryp的均方根差 (RMSD)Fig.5 Root mean square deviation (RMSD) of MYT and Tryp

2.3.2 分子动力学模拟

将分子对接得分最高的结果导入到一个立方体水箱中,在30 ns内进行分子动力学模拟,并研究对接结果的分子动力学稳定性。分子动力学模拟过程中Tryp与MYT的均方根差(root mean square deviation, RSMD)随时间变化的结果如图5所示。

由图5可见,Tryp与MYT在1.5 ns左右达到平衡,在随后的模拟时间内主客体的RMSD整体上波动相对较小,表明主客体构象变化不大,在30 ns时间内主客体的平均RMSD分别为1.672与1.255 Å。分子动力学模拟表明,Tryp:MYT复合物结构稳定,与分子对接结果相吻合。

图6 Tryp与MYT的相互作用柱状图Fig.6 Histogram graph of interactions between Tryp and MYT

图6给出30 ns分子动力学轨迹中Tryp与MYT的相互作用情况,可以观察到在整个分子动力学模拟过程中,Tyr39, His40, Phe41, Trp141, Tyr151, Pro152, Gly193等残基与MYT之间在较长时间(大于总时间50%)保持相互作用,主客体间相互作用包括疏水、氢键及水桥作用,此结果与分子对接结果相符,表明30 ns分子动力学模拟并未改变主客体之间的相互作用类型。由此可见,Tryp:MYT复合物具有较好的动力学稳定性。

3 结 语

本文的实验结果表明,在pH=8.4的条件下,温度分别为17, 27, 37 ℃时,MYT可以有效地猝灭Tryp的荧光发射。根据Stern-Volmer方程以及双对数方程求得MYT猝灭Tryp的机制为静态猝灭。使用Van’t Hoff方程求得主客体结合的热力学常数 ΔH>0,ΔS>0,ΔG<0,表明复合物的形成是一个熵增加且吸热的自发过程,疏水与氢键作用对于复合物的形成具有促进作用。随后本文利用同步荧光法研究Tryp与MYT的结合位点,结果表明MYT与Tryp的结合对Tyr, Phe, His以及Trp残基的影响基本相同。分子对接表明,MYT结合在Tryp表面,通过疏水作用以及氢键作用与Tryp结合。分子动力学模拟表明,Tryp:MYT复合物的动力学性质稳定,在30 ns时间内主客体的平均RMSD分别为1.672 Å与1.255 Å。本研究有助于深入了解MYT与Tryp的相互作用机制,为药物小分子与大分子结合研究提供了基础数据及依据。