miR-548a-3p调控TLR4抑制脂多糖诱导结肠上皮细胞的凋亡

凌 琳 游丽娟 袁 葵

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种病因不明，以慢性复发性肠道炎症为主要特征的疾病，UC患者常出现腹泻、营养不良、腹腔内脓肿和肠道狭窄等症状，严重影响患者的生活质量[1]。由于UC病因不明，临床上主要使用免疫抑制剂或生物制剂来缓解UC患者症状[2-3]，需要识别UC发病机制以寻找新的治疗方法。微小RNAs(miRNAs)是一类长度在19～25个核苷酸的非编码RNA，通过与靶基因结合参与多种病理生理过程[4]。有研究[5]发现，过表达miR-190能显著减少脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的结肠上皮细胞的炎症因子分泌和细胞凋亡。但是miR-548a-3p在LPS诱导的结肠上皮细胞中作用以及相关机制报道较少。基于此，本研究将miR-548a-3p模拟物和miR-548a-3p抑制剂转染进LPS诱导的结肠上皮细胞，观察miR-548a-3p对结肠上皮细胞炎症因子分泌、增殖和凋亡的影响，并进一步识别miR-548a-3p的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2019年1月至2020年5月南方医科大学深圳医院35例UC患者的肠道黏膜组织，所有患者均经肠镜及病理学检查确诊为活动期UC患者，其中男性20例，女性15例，年龄36～57岁。对照组选自该院接受肠镜检查并进行肠道黏膜组织活检的健康体检者，其中男性20例，女性15例，年龄38～59岁。所有组织样本获取后立即置于液氮保存。排除标准：近期服用过抗炎药、有严重肝肾功能障碍者。结肠上皮细胞NCM460和上皮细胞培养基购于上海盈湾生物科技有限公司；miR-548a-3p模拟物、miR-548a-3p抑制剂和阴性对照购于上海吉满生物科技有限公司；LipofectamineTM2000转染试剂、逆转录试剂盒和定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, qRT-PCR)试剂盒购于美国赛默飞世尔科技公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒、细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8, CCK-8)、人类TNF-α ELISA Kit、人类IL-8 ELISA Kit和一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；一抗兔多克隆抗体Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)、兔单抗B细胞淋巴瘤/白血病-2基因-相关X蛋白(B cell lymphoma/leukemia-2 gene-associated X protein-associated X protein，Bax)、兔单抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、兔单抗磷酸甘油醛脱氢酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH)和二抗山羊抗兔IgG (H+L)购于武汉爱博泰克生物科技有限公司。患者样本的收集和使用经南方医科大学深圳医院伦理委员会批准(伦理批号：ZLC20181205)。

1.2 细胞培养与转染 将结肠上皮细胞NCM460细胞培养于细胞培养基中，并在37 ℃、5 %CO2的培养箱中培养。取对数生长期NCM 460细胞，以2×103个/孔的密度接种于6孔板上，将NCM 460细胞分为对照组、LPS组、miR-NC组、miR-548a-3p mimics组、miR-548a-3p inhibitor组和miR-548a-3p mimics+pcDNA3.1-TLR4组。对照组不做任何处理；LPS组使用含50 μg/mL LPS的上皮细胞培养基培养；miR-NC组、miR-548a-3p mimics组、miR-548a-3p inhibitor组和miR-548a-3p mimics+pcDNA3.1-TLR4组中将miR阴性对照序列，miR-548a-3p模拟物、miR-548a-3p抑制剂、miR-548a-3p模拟物和TLR4过表达质粒分别转染进NCM460细胞，随后给予LPS处理。

1.3 qRT-PCR检测miR-548a-3p的表达 使用Trizol试剂提取组织和细胞总RNA，再将提取的总RNA反转录成cDNA，并在-20℃条件下保存。以U6小核1 (U6 small nuclear 1, U6)为内参检测miR-548a-3p的表达。PCR反应条件为：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃30 s，73℃ 10 s共40个循环，采用2-△△Ct法计算相对表达量。

1.4 CCK-8检测细胞增殖情况 转染48 h后，取对数生长期的细胞，以1×103个/孔的密度接种于96孔板上。分别在24、48和72小时于每孔滴加15 μL CCK-8溶液，培养4 h，用酶标仪测定每孔细胞在450 nm处的吸光度(A)值。

1.5 ELISA法检测细胞炎症因子分泌情况 按说明书制备标准品，于每孔滴加50 μL检测缓冲液，分别加入标准品、对照品和收集的各组细胞上清液，然后加入检测抗体，封板膜封闭，于37 ℃下孵育，2 h后洗板，加入100 μL二抗，封板膜封闭，37 ℃孵育45 min，洗板，每孔加3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’ -tetramethylbenzidine，TMB)显色液80 μL，于37 ℃避光反应15 min，最后于每孔加终止液100 μL，用酶标仪测量光密度(optical density，OD)值。根据标准曲线和样品的OD值，计算各炎症因子浓度。

1.6 TUNEL检测细胞凋亡情况 取各组对数期生长细胞，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)洗涤，用4 %多聚甲醛固定60 min，PBS洗涤1次，用含0.3 % Triton X-100的PBS重悬细胞，5 min后向每个样品加50 mL TUNEL检测液，在37 ℃下避光孵育60 min，孵育结束后，PBS洗涤，用4,6-联脒-2-苯基吲哚(4, 6-amidine-2-phenylindole，DAPI)染色后在荧光显微镜下计数凋亡数量和总细胞数量，采用TUNEL末端标记法计算细胞凋亡率。

1.7 双荧光素酶报告实验验证miR-548a-3p与TLR4的靶向关系 根据Star Base在线数据库检测miR-548a-3p与TLR4的结合位点，将吉满生物技术有限公司合成的TLR4 3’UTR-WT和TLR4 3’UTR-MUT，分别与miR-548a-3p mimics或miR-NC(miR阴性对照序列)通过脂质体2000(lipofectamine 2000)共转染入细胞。48 h后，用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组荧光素酶相对活性。

1.8 Western blot检测目标蛋白表达 使用放射免疫沉淀实验(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液裂解NCM 460细胞，提取总蛋白，用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法测定蛋白浓度。取40 μL蛋白样品进行上样，电泳结束后，转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，封闭，加入相应一抗，4℃孵育过夜，洗膜缓冲液(tris buffered saline tween，TBST)洗涤，加入二抗室温孵育1 h，电化学发光法(electrochemical luminescence，ECL)显影，用 Image J 软件分析灰度值。

2 结果

2.1 miR-548a-3p在UC组织和LPS诱导的结肠上皮细胞中的表达 对GSE48957数据集进行分析发现，miR-548a-3p在活动期UC患者结肠黏膜中低表达。见图1。RT-qPCR结果显示，UC患者肠黏膜组织miR-548a-3p的表达水平低于正常肠黏膜组织，差异有统计学意义[(1.684±0.733)比(1.130±0.568)，t=3.534，P<0.001]；LPS诱导的结肠上皮细胞中miR-548a-3p的表达水平低于对照组，差异有统计学意义[(1.001±0.090)比(0.463±0.042)，t=9.382，P<0.001]。

图1 miR-548a-3p在UC组织和LPS诱导的

2.2 LPS对结肠上皮细胞增殖、凋亡和炎症因子分泌的影响 与对照组相比，LPS组24小时和48小时细胞增殖水平较低，凋亡率较高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图2A。此外，LPS组Bax和Caspase 3表达，TNF-α和IL-8含量高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图2B。

表1 各组细胞增殖水平和凋亡率的比较

表2 各组细胞凋亡蛋白和炎症因子含量的比较

注：A，TUNEL检测对照组和LPS组凋亡率；B，Western blot检测对照组和LPS组中Bax和Caspase3表达。

2.3 miR-548a-3p对结肠上皮细胞炎症因子分泌和凋亡蛋白表达的影响 ELISA实验显示，miR-548a-3pinhibitor组TNF-α、IL-8含量、Bax、Caspase 3表达水平高于miR-NC组，差异有统计学意义(均P<0.05)；miR-548a-3pmimics组TNF-α、IL-8含量、Bax、Caspase 3表达水平低于miR-NC组，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表3、图3。

表3 各组细胞炎症因子分泌和凋亡蛋白表达的比较

图3 miR-548a-3p对结肠上皮细胞凋亡蛋白表达的影响

2.4 各组细胞增殖水平和凋亡率比较 与miR-NC组相比，miR-548a-3p inhibitor组细胞凋亡率较高，24小时和48小时细胞增殖水平较低，差异有统计学意义(均P<0.05)。与miR-NC组相比，miR-548a-3p mimics组细胞凋亡率较低，24小时和48小时细胞增殖水平较高，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表4、图4。

表4 各组细胞增殖和凋亡情况的比较

图4 miR-548a-3p对LPS诱导的结肠上皮细胞凋亡的影响

2.5 miR-548a-3p与TLR4靶向关系 验证通过检索miRDB和Targetscan数据库找到能与miR-548a-3p存在互补结合位点的mRNA，并绘制韦恩图，见图5A。Targetscan数据库显示，TLR4和miR-548a-3p的潜在互补结合位点，见图5B。与miR-NC组相比较，miR-548a-3p组可降低含野生型TLR4荧光素酶报告质粒相对萤光素酶活性[1.011±0.100)比(0.507±0.043),t=11.341,P<0.001]。miR-NC组和miR-548a-3p组中含突变型TLR4荧光素酶报告质粒的相对萤光素酶活性差异无统计学意义[(0.982±0.090)比(1.020±0.102),t=0.684,P=0.509]，见图5C。Western blot实验结果显示，miR-NC组,miR-548a-3p inhibitor组和miR-548a-3p mimics组中TLR4蛋白表达分别为：(1.167±0.122)、(2.102±0.162)、(0.579±0.061)，F=236.761,P<0.001。 与miR-NC组相比，miR-548a-3p inhibitor组TLR4蛋白表达量升高(P<0.001), miR-548a-3p mimics组TLR4蛋白表达量降低(P<0.001)。

注：A，与miR-548a-3p存在潜在互补结合位点的mRNA；B，二者互补结合位点；C，Western blot检测各组结肠上皮细胞TLR4表达。

2.6 TLR4对LPS诱导结肠上皮细胞增殖、凋亡和炎症因子分泌的影响 与miR-548a-3p mimics组相比，miR-548a-3p mimics组+pcDNA3.1-TLR4组中Bax蛋白和Caspase3蛋白表达较高，细胞凋亡率较高，24小时和48小时吸光度较低，TNF-α含量和IL-8含量较高，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表5、6。

表5 各组细胞增殖和凋亡率的比较

表6 各组细胞凋亡蛋白和炎症因子分泌的比较

图6 各组细胞凋亡蛋白表达的比较

3 讨论

UC是发生在消化道的慢性复发性炎性疾病，其病因和发病机制尚不清晰，可能与肠黏膜组织内免疫调节紊乱、肠黏膜屏障受损和持续性肠道感染有关[6-7]。本研究用LPS诱导结肠上皮细胞来构建溃疡性结肠炎细胞模型[8-9]，发现与对照组相比，LPS组中炎症因子水平和细胞凋亡率显著升高，细胞增殖能力显著降低。

miRNA可通过调节靶基因参与多种细胞行为，且在控制细胞炎症反应中也发挥着重要作用[10-11]。既往有研究[12]发现，过表达miR-548a-3p可显著增强肝癌细胞增殖、集落形能力并抑制凋亡。而对于肺癌细胞，过表达miR-548a-3p能显著促进肺癌细胞的凋亡，并抑制肺癌细胞侵袭和凋亡的发生[13]。在糖尿病中，有研究[14]表明，miR-548a-3p在患者血清外泌体和外周血单核细胞中显著下调，其可通过调控相关信号通路参与疾病进展。此外，miR-548a-3p在IL-22刺激的人角质形成细胞表达中显著上调，通过下游靶基因调控相关蛋白发挥角质形成细胞增殖的作用[15]。

本研究发现，miR-548a-3p在UC患者组织和LPS组中显著下调，miR-548a-3p可抑制炎症因子的表达，降低细胞凋亡率并促进细胞增殖。TLR4在结肠上皮细胞中广泛表达，而TLR4异常表达被认为是UC潜在发病机制之一[16]。有既往研究[17]发现，miR-31能通过上调TLR4的表达介导UC小鼠肠上皮细胞凋亡，从而促进小鼠结肠炎的发展。而在另一项研究[18]中显示，miR-542-3p能通过抑制TLR4蛋白表达来减轻UC大鼠结肠组织炎症反应程度。TLR4在UC患者血清中显著上调，且TLR4表达水平与UC患者病情严重程度成正比[19]。TLR4是miR-548a-3p的靶基因，TLR4过表达质粒可逆转miR-548a-3p对LPS诱导的结肠上皮细胞凋亡、炎症因子分泌的抑制作用，和对细胞增殖的促进作用。

综上所述，本研究发现miR-548a-3p通过下调TLR4表达，能显著抑制LPS诱导的结肠上皮细胞炎症因子分泌和细胞凋亡，为UC患者治疗提供了新的可能靶点。