甘油酯提取三角褐指藻中岩藻黄素的工艺研究

赵新杰，高丽伟，赵祥忠

(齐鲁工业大学(山东省科学院)食品科学与工程学院，济南 250353)

岩藻黄素(fucoxanthin，Fx)又被称为褐藻黄素，是一种脂溶性的天然类胡萝卜素，广泛存在于褐藻和硅藻中[1]。岩藻黄素分子结构(见图1)中含有的丙二烯键和羟基发色团尾端使其具有重要的生物活性[2]。现已有研究证明岩藻黄素具有抗肿瘤[3]、抗炎[4]、清除自由基[5]、减肥[6]、抗糖尿病[7]等生物学功效。三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)属硅藻门中的单细胞海洋微藻，因其细胞色素组成中岩藻黄素含量较高，被认为是岩藻黄素的最佳来源。Kim等[8]通过液相色谱分析确定了三角褐指藻中岩藻黄素的含量在15.71～16.51 mg/g(干重)之间，是大型海藻的10倍以上。

图1 岩藻黄素结构式

三角褐指藻中的岩藻黄素一般使用有机溶剂进行萃取，使用有机溶剂不但污染环境，而且有机溶剂的残留会危害人体健康，目前已有多种其他提取方法，如微波法[9]、酶解法[10]、超临界流体萃取法[11]、加压辅助d-柠檬烯提取法等[12]。食用油被视为“绿色”溶剂，一些论文报道了利用植物油从虾废料[13]和雨生红球藻[14]中提取类胡萝卜素的研究。用食用油提取类胡萝卜素的优点是经济、环保，甚至无需任何纯化就可以直接将提取物用作食品原料。甘油酯在食品加工中常被用作食品添加剂，本研究筛选6种不同链长的脂肪酸甘油酯进行岩藻黄素的提取研究，旨在获得三角褐指藻中岩藻黄素“绿色提取”的最佳工艺及参数。

1 材料和方法

1.1 材料

三角褐指藻：荣成市寻山集团有限公司。

1.2 试剂

三乙酸甘油酯(分析纯)：无锡市亚泰联合化工有限公司；三丁酸甘油酯、三辛酸甘油酯(均为分析纯)：上海麦克林生化科技有限公司；辛癸酸甘油酯(分析纯)：今品化学技术(上海)有限公司；花生油：嘉里粮油(青岛)有限公司；芝麻油：瑞福油脂股份有限公司。

1.3 主要仪器与设备

UV-5100型紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；LG-0.2型真空冷冻干燥机 新阳速冻设备制造有限公司；TG16-WS型台式高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；JA5003型电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅 郑州科泰实验设备有限公司；KQ-100DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；XW-80A型旋涡混合仪 海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.4 方法

1.4.1 样品前处理

将浓缩后的三角褐指藻藻液于真空冷冻干燥机中冷冻干燥48 h，然后粉碎成粉末(150 μm以下)于-20 ℃下保存备用。

1.4.2 提取方法

准确称取0.2 g三角褐指藻藻粉，加入5 mL甘油酯于10 mL离心管中旋涡混匀1 min，置于恒温水浴锅中以设定的温度浸提一定时间，期间每隔30 min取出旋涡混匀一次。浸提结束后取出以6000 r/min离心15 min取上清液，稀释一定倍数后在449 nm波长处测定样品的吸光值。整个过程中对样品进行遮光处理。每个样品进行3次平行试验，最终结果取3次试验的平均值。

1.4.3 岩藻黄素含量的计算

根据Lambert-Beer定律[15]计算提取液中Fx的含量：

公式(1)

1.4.4 不同链长脂肪酸甘油酯的单因素试验

根据1.4.2中的提取方法，选取两种短链脂肪酸甘油酯：三乙酸甘油酯和三丁酸甘油酯，两种中链脂肪酸甘油酯：三辛酸甘油酯和辛癸酸甘油酯，以及两种长链脂肪酸甘油酯：花生油和芝麻油，分别以提取温度、提取时间、超声时间以及蔗糖脂肪酸酯的添加比例为单一变量进行单因素试验，以岩藻黄素的提取率为指标，研究这4个变量对脂肪酸甘油酯提取岩藻黄素的影响，以确定较好的试验参数范围。

1.4.5 正交设计优化试验

在单因素试验的基础上，选取提取效果最好的脂肪酸甘油酯，以提取温度、提取时间、超声时间、蔗糖脂肪酸酯添加比例进行四因素三水平L9(34)正交试验，进一步优化脂肪酸甘油酯对岩藻黄素的提取条件，正交试验因素水平表见表1。

表1 L9(34)正交试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同链长脂肪酸甘油酯对岩藻黄素的提取结果

首先将选取的6种不同链长的脂肪酸甘油酯在45 ℃条件下浸提三角褐指藻藻粉2 h作为对照，并通过公式(1)计算Fx的含量，结果见图2。

图2 不同链长脂肪酸甘油酯中岩藻黄素的提取含量

由图2可知，三乙酸甘油酯和辛癸酸甘油酯有相对较高的Fx提取含量，其Fx提取含量分别为3.028 mg/g和3.197 mg/g，而花生油和芝麻油对Fx的提取量较低，仅有2.034 mg/g和2.494 mg/g。花生油和芝麻油是含有多种不饱和脂肪酸的混合物，其中花生油中含有41.2%的油酸和37.65%的亚油酸，芝麻油的主要组成成分为油酸、亚麻酸和棕榈酸[16]。花生油和芝麻油的Fx提取含量低于短链和中链脂肪酸甘油酯，这可能和它们的复杂组成有关。从流动性来看，花生油和芝麻油的流动性也明显低于短链和中链脂肪酸甘油酯，这也可能是导致它们提取率低的原因之一。

2.1.2 温度对岩藻黄素提取的影响

温度能够影响物质内部的分子运动，有利于活性物质的扩散。因此，将藻粉分别在35，45，55，65，75 ℃ 5个不同的温度条件下提取2 h，探究温度对不同脂肪酸甘油酯提取Fx的影响，并确定它们的最适提取温度，结果见图3。

图3 温度对岩藻黄素提取的影响

由图3可知，温度对Fx的提取有十分显著的影响，特别是对短链、中链脂肪酸甘油酯的浸提效果。随着温度的升高，短链、中链脂肪酸甘油酯中Fx的含量有明显的升高，三乙酸甘油酯和辛癸酸甘油酯在65 ℃时有最大的提取率，提取含量分别为4.325 mg/g和3.873 mg/g，比对照组的Fx含量分别提高了42.83%和21.14%。三丁酸甘油酯和三辛酸甘油酯在55 ℃时达到最大，分别是2.925 mg/g和3.011 mg/g，比对照组分别提高了15.48%和8.31%。随着提取温度的升高，短链、中链脂肪酸甘油酯中Fx含量呈现出不同程度的下降，这是由于温度升高，体系内的分子运动加剧，有助于Fx的提取，但是达到一定温度后，Fx由于受热很不稳定，会随着温度的升高而分解，导致提取率下降[17]。因此，岩藻黄素的提取温度在55～65 ℃之间较为理想，与Zhang等[18]关于岩藻黄素在40～70 ℃之间稳定性较高的研究结果一致。

此外，食用油对类胡萝卜素的降解起屏障作用[19]。但是，食用油的高黏度可能导致低扩散率，因此即使在高温下提取率也较低。这可能是花生油和芝麻油在试验温度范围内Fx提取量一直升高但提取率却很低的原因。

2.1.3 时间对岩藻黄素提取的影响

在45 ℃的恒温条件下，分别用6种不同链长的脂肪酸甘油酯浸提三角褐指藻藻粉60，120，180，240，300 min，Fx含量见图4。

图4 时间对岩藻黄素提取的影响

由图4可知，在180 min时，短链和中链脂肪酸甘油酯中Fx的含量基本上达到饱和，随着提取时间的延长，Fx含量仅有少量的增加。与此不同的是，长链脂肪酸甘油酯中的芝麻油在整个提取过程中Fx的含量一直在提高，花生油也表现出相同的增长趋势。芝麻油的提取效果甚至超过了三丁酸甘油酯和三辛酸甘油酯的提取量，在浸提300 min时达到了3.271 mg/g的Fx含量。浸提时间的延长有利于岩藻黄素的溶出，但过长的时间会导致岩藻黄素氧化分解的加剧，因此结合图4中的试验结果，短链、中链脂肪酸甘油酯提取时间在180～240 min之间为宜，长链脂肪酸甘油酯提取时间在240～300 min之间较好。

2.1.4 超声波处理对岩藻黄素提取的影响

超声处理主要是利用超声波的功率特性，借助热效应、机械作用和空化作用，改变或者加速改变物质的某些物理、化学、生物特性或状态，短时间内实现细胞破裂，提高活性成分的提取效率[20]。在45 ℃浸提2 h的过程中，利用超声波清洗器以100 W的功率对样品进行10，15，20，25，30 min的超声处理，以考察超声时间对甘油酯提取Fx的影响，提取结果见图5。

图5 超声时间对岩藻黄素提取的影响

由图5可知，短链脂肪酸甘油酯的最佳超声处理时间为20 min，在此条件下三乙酸甘油酯和三丁酸甘油酯提取的Fx含量分别为4.296 mg/g和2.958 mg/g，比未经过超声处理的对照组分别提高了41.88%和16.78%。超声处理对中链脂肪酸甘油酯的影响比短链脂肪酸甘油酯显著，在超声时间为25 min时，三辛酸甘油酯和辛癸酸甘油酯的Fx提取含量分别为3.647 mg/g和4.113 mg/g，比对照组分别提高了31.19%和28.65%。在短时间内，超声作用促进了三角褐指藻细胞的破裂，Fx分子不断扩散与提取溶剂发生作用，提取效果显著提高，但是超过一定时间后，一些如热效应、化学效应的反应会对Fx产生破坏，继续超声处理可能会破坏Fx，使提取率下降[21]。

长链脂肪酸甘油酯中的花生油和芝麻油在超声辅助下Fx的浸出含量一直上升，在超声处理30 min后，芝麻油中Fx的含量为3.459 mg/g，比对照组提高了38.42%，考虑到长时间超声处理对岩藻黄素结构的破坏，因此花生油和芝麻油的最佳超声时间为30 min。

2.1.5 不同比例的蔗糖脂肪酸酯对甘油酯浸提的影响

乳化剂是一种表面活性物质，分子中同时具有亲水基和亲油基，能够改善体系的稳定性。食品乳化剂是一类多功能的高效食品添加剂，除了具有典型的表面活性之外，在食品中还具有稳定、润滑、助溶等作用[22]。

蔗糖脂肪酸酯是一种非离子表面活性剂，由蔗糖和脂肪酸经酯化反应生成。在Fx的提取过程中，加入不同比例的蔗糖脂肪酸酯作为乳化剂，可以提高甘油酯的流动性，有助于Fx的溶出。不同比例蔗糖脂肪酸酯的添加对不同链长脂肪酸甘油酯提取Fx的影响见图6。

图6 蔗糖脂肪酸酯添加比例对岩藻黄素提取的影响

由图6可知，随着蔗糖脂肪酸酯添加比例的不断增加，短链脂肪酸甘油酯的提取率在不断下降。中链脂肪酸甘油酯在添加比例1.5%以下时，有利于Fx的提取，继续增加蔗糖脂肪酸酯的量将会阻碍Fx的溶出。然而，蔗糖脂肪酸酯的加入却很有利于长链脂肪酸甘油酯对Fx的提取。在短链脂肪酸甘油酯中，三乙酸甘油酯和三丁酸甘油酯的最适蔗糖脂肪酸酯添加比例为0.5%，此时Fx的含量分别为3.429 mg/g和2.648 mg/g，仅比对照组分别提高了13.24%和4.54%。辛癸酸甘油酯在蔗糖脂肪酸酯添加比例为1.0%时，Fx有最大提取含量3.415 mg/g，比对照组含量提高了6.79%。三辛酸甘油酯在蔗糖脂肪酸酯添加比例为1.5%时有最大提取量3.184 mg/g，相对于对照组Fx含量提高了14.53%。

蔗糖脂肪酸酯对花生油和芝麻油的影响大于对短链和中链脂肪酸甘油酯的影响。芝麻油和花生油在蔗糖脂肪酸酯比例为1.5%和2.0%时，Fx最大提取含量分别为3.014 mg/g和2.918 mg/g，比对照组分别提高了20.85%和43.46%。

2.2 正交试验设计及结果分析

根据单因素试验结果，选取提取效果较好的三乙酸甘油酯进行正交优化，正交试验设计及结果见表2。

表2 正交试验设计及结果

由表2可知，各因素的极差R值大小为A>C>D>B，表明4个因素对Fx提取率的影响程度由高到低为提取温度>超声时间>蔗糖脂肪酸酯添加比例>提取时间。综合分析各因素的k值，确定三乙酸甘油酯提取Fx的最优条件组合为A2B3C3D2，即提取温度65 ℃、提取时间4 h、超声时间25 min、蔗糖脂肪酸酯添加比例0.5%。

在最佳提取条件下进行3次平行提取试验，经计算得出三乙酸甘油酯对三角褐指藻中Fx的最大提取率为5.129 mg/g，相对标准偏差为0.54%，表明优化条件合理可行。

3 结论

本试验以可食用的脂肪酸甘油酯作为提取溶剂，浸提三角褐指藻中的岩藻黄素，通过对6种不同链长的脂肪酸甘油酯进行单因素试验，探究了提取温度、提取时间、超声处理以及蔗糖脂肪酸酯对岩藻黄素提取的影响。结果表明，提取温度和提取时间对短链、中链脂肪酸甘油酯的影响较大，而超声处理和蔗糖脂肪酸酯对长链脂肪酸甘油酯的影响较大。总的来说，短链和中链脂肪酸甘油酯的提取效果好于长链脂肪酸甘油酯，其中提取效果较好的有三乙酸甘油酯、辛癸酸甘油酯和芝麻油，三乙酸甘油酯和辛癸酸甘油酯的最适提取条件为：三乙酸甘油酯在提取温度65 ℃、超声处理20 min、蔗糖脂肪酸酯添加比例0.5%的条件下提取180 min；辛癸酸甘油酯在提取温度65 ℃、超声处理25 min、蔗糖脂肪酸酯添加比例0.5%的条件下提取180 min。

在单因素试验的基础上，选取提取效果较好的三乙酸甘油酯进行四因素三水平的正交优化试验，确定了三乙酸甘油酯提取Fx的最优条件为提取温度65 ℃、提取时间4 h、超声时间25 min、蔗糖脂肪酸酯添加比例0.5%。在此最佳提取条件下Fx的最大提取含量为5.129 mg/g。