饲料添加L-精氨酸或N-氨甲酰谷氨酸对杂交鳢生长性能、血浆生化指标、肠道功能及抗氧化能力的影响

李培佳 侯冬强* 赵红霞 陈 冰 彭 凯 黄 文,3 郑春田 曹俊明

(1.广东省农业科学院动物科学研究所，农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广州 510640；2.广东海洋大学水产学院，湛江 524088；3.广州飞禧特生物科技有限公司，广州 510640)

精氨酸(Arg)作为鱼类必需氨基酸，参与机体蛋白质、肌酸等合成，对促进水生动物生长、提高机体抗氧化能力等方面极为重要[1]。研究结果表明，Arg可提高养殖动物饲料效率和蛋白质沉积率[2]；降低血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性，维持正常氨基酸代谢能力[3]；提高肠道谷胱甘肽过氧化物酶活性，增强机体抗氧能力[4]；降低肠道丙二醛含量，减少肠道氧化损伤[5]。N-氨甲酰谷氨酸(NCG)作为N-乙甲酰谷氨酸(NAG)类似物，可激活氨甲酰磷酸合酶-1(CPS-1)，促进内源性Arg合成[6-7]。同时作为一种安全、代谢稳定的营养物质，可在治疗疾病有关的方面发挥有益作用[8]。然而，饲料中直接添加Arg在体内易被精氨酸酶降解，并且会影响机体对其他氨基酸的吸收效率。因此，利用NCG内源性合成Arg是目前解决Arg使用问题的可行方法，饲料中直接添加NCG，不仅代谢稳定性高，而且吸收效率强，相对于饲料补充Arg大幅降低了饲料成本。

杂交鳢子一代较斑鳢(Channamaculata)、乌鳢(ChannaArgus)在生长性能、抗病能力方面有显著优势。目前在水产养殖中，易驯食人工配合饲料，养殖周期短，珠三角养殖产量占比较高[9]。近年来，随着养殖产量不断攀升，营养性、微生物性疾病不断增多。本实验室开展了杂交鳢对Arg需要量的养殖试验，试验结果表明，杂交鳢Arg适宜水平为2.91%～2.98%[10]。目前，由于不同鱼种饲料添加Arg存在其他氨基酸吸收拮抗、投入成本太高等因素，因此内源性合成Arg途径成为高效经济的方法，但是关于NCG在水产动物饲料中的应用研究较少。NCG研究主要集中为内源性激活Arg，也有研究证明，饲料添加NCG可提高大菱鲆(Scophthalmusmaximus)的生长性能[11]，改善镜鲤(Cyprinuscarpio)的机体免疫活性[12]。NCG在鱼类机体内可内源性合成Arg，生成的Arg与NCG比值为(10～20)∶1[13]。本实验室开展了Arg或NCG在黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)中的应用试验，发现黄颡鱼饲料中NCG的适宜添加水平是Arg适宜添加水平的1/20[14]。在黄颡鱼[14]、大菱鲆[11]、花鲈(Lateolabraxmaculatus)[15]、罗非鱼(Oreochromismossambicus)[16]、镜鲤[12]等水产动物中的研究表明，NCG在饲料中的适宜添加水平为0.03%左右。前期开展试验获得的杂交鳢饲料Arg适宜添加水平为0.6%[10]，本试验NCG添加水平设计主要依据以上研究文献，按照杂交鳢饲料Arg适宜添加水平的1/20即0.03%添加。本试验通过在饲料中添加Arg或NCG，研究其对杂交鳢幼鱼生长性能、体成分、肠道功能、血浆生化指标及抗氧化能力的影响，为NCG在杂交鳢配合饲料中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

基础饲料的主要原料为鱼粉、面粉、豆粕、玉米蛋白粉，在基础饲料中分别添加0(对照)、0.60% Arg(L-Arg，纯度≥98%)、0.03% NCG(纯度≥98%)配制成3种试验饲料。饲料Arg含量采用GB/T 18246—2019的常规酸水解法测定。饲料营养水平及维生素预混料、矿物质预混料添加水平按照乌鳢营养需求量添加[17]。试验饲料组成及营养水平见表1。

表1 试验饲料组成及营养水平(干物质基础)

根据饲料配方将原料粉碎，要求过60目筛，而后进行称量，称量后将其逐级混匀，加入磷脂油、豆油、鱼油、水进行再次混匀，混匀后，将原料置于膨化机内膨化制成膨化颗粒饲料(华强膨化机械T52型膨化机)，而后将膨化饲料置于55 ℃温度烘干。

1.2 试验设计及养殖管理

将杂交鳢鱼苗(锦龙渔业有限公司)运输至广东省农业科学院动物科学研究所白云实验基地。鱼苗运回后在暂养网箱暂养1周，暂养网箱规格为2.5 m×2.5 m×1.5 m，暂养期每天饱食投喂2次基础饲料，暂养结束后饥饿24 h开始正式试验。随机挑选初始体重为(22.02±0.02)g、体格健壮的杂交鳢鱼苗450尾，随机分为3组，分别为对照组、0.60% Arg组、0.03% NCG组，每组3个重复(网箱)，每个网箱50尾鱼，分别投喂3种试验饲料。

试验网箱规格为1.5 m×1.5 m×1.5 m，水体有效体积为293 L，饲喂8周。每天08:00、16:00定时表观饱食投喂2次，并根据水温、摄食和生长等因素调整投喂量，并记录摄食及死亡情况。每日对养殖环境进行检测，要求溶氧含量大约为8 mg/L，酸碱度大约为8.0，水温为25～32 ℃，氨氮含量小于0.1 mg/L。

1.3 样品采集及测定指标

1.3.1 生长性能和形态学指标

生长性能和形态学指标计算公式如下：

存活率(survival rate，SR，%)=100×F末/F初;增重率(weight gain rate，WGR，%)=100×(W末-W初)/W初;饲料系数(feed coefficient rate，FCR)=D总/(W末-W初);蛋白质沉积率(protein deposition rate，PDR，%)=100×(W末×CP末-W初×CP初)/(D×CP饲料);特定生长率(specific growth rate，SGR，%/d)=100×(LnW末-LnW初)/T;肥满度(condition factor，CF，g/cm3)=100×W/L3;肝体比(hepatopancreas somatic indices，HIS，%)=100×W肝脏/W;脏体比(viscera somatic indices，VSI，%)=100×W内脏/W。

式中：F初为初始尾数；F末为终末尾数；W为体重；L为体长；W初为初始鱼体重；W末为终末鱼体重；CP初为初始鱼体蛋白质含量；CP末为终末鱼体蛋白质含量；CP饲料为饲料蛋白质含量；D总为摄入饲料总重；D为饲料摄入量；T为养殖时间；W肝脏为肝脏重；W内脏为内脏重。

1.3.2 饲料营养水平及鱼体营养成分测定

养殖试验结束后进行样品采集，将试验鱼禁食24 h，记录每个试验网箱称重计数结果。随后从每个网箱中随机选取3尾鱼检测鱼体营养成分。饲料及鱼体粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、水分含量分别采用GB/T 6432—2018、GB/T 6433—2006、GB/T 6438—2007、GB/T 6435—2014的方法进行测定。

1.3.3 血浆制备及生化指标测定

从每个网箱中随机选取8尾鱼抽取血液制备血浆，首先采用浓度为120 mg/L MS-222溶液麻醉，尾静脉采血法采集血液，肝素钠抗凝管收集血液，将采集好的血液采用离心机4 000 r/min进行离心，离心时间10 min，制备血浆。

血浆总蛋白(total protein，TP)含量采用双缩脲法测定，谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)、谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)活性采用速率法测定,尿素氮(urea nitrogen，UN)含量采用酶偶联速率法测定，总胆固醇(total cholesterol，TCHO)、甘油三酯(triglyceride，TG)、葡萄糖(glucose，GLU)含量采用酶活性法测定。血浆生化指标采用的测定仪器均为全自动化分析仪(贝克曼ProCX4，德国)。

1.3.4 肠道消化酶、功能性指标及血浆抗氧化指标测定

从每个网箱中随机选取3尾鱼解剖后取肠道组织，进行肠道消化酶、功能性指标检测。采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定肠道蛋白酶、脂肪酶(lipase，LPS)、淀粉酶(amylase，AMS)、Na+/K+ATP酶(sodium-potassium ATPase，Na+/K+ATPase)、γ-谷氨酰基转移酶(γ-glutamyltransferase，γ-GT)，血浆超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、过氧化物酶(peroxidase，POD)活性，总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，测定方法、步骤、计算公式等见试剂盒说明书。

1.4 数据统计与分析

试验数据分析结果均以平均值±标准差(mean±SD)表示，数据采用SPSS 25.0统计软件进行单因素方差分析，而后采用Duncan氏法进行多重比较，差异显著水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 饲料添加Arg和NCG对杂交鳢生长性能及形态学指标的影响

由表3可知，与对照组和0.03% NCG组相比，饲料中添加0.60% Arg显著提高了杂交鳢WGR及SGR(P<0.05)。对照组和0.03% NCG组间杂交鳢WGR及SGR没有显著差异(P>0.05)。与对照组相比，饲料中添加0.60% Arg和0.03% NCG显著降低了杂交鳢FCR(P<0.05)。与对照组相比，饲料中添加0.60% Arg和0.03% NCG显著提高了杂交鳢的PDR及SR(P<0.05)，0.60% Arg和0.03% NCG组间PDR和SR显著差异(P<0.05)。与对照组相比，各试验组CF、HSI、VSI无显著差异(P>0.05)。

表3 饲料添加Arg和NCG对杂交鳢鱼体成分的影响

2.2 饲料添加Arg和NCG对杂交鳢鱼体成分的影响

由表4可知，与对照组相比，饲料中添加0.60% Arg和0.03% NCG显著增加了杂交鳢全鱼CP含量(P<0.05)。饲料中添加0.60% Arg或0.03% NCG对杂交鳢全鱼水分、EE、Ash含量无显著影响(P>0.05)。

表4 饲料添加Arg和NCG对杂交鳢血浆生化指标的影响

2.3 饲料添加Arg和NCG对杂交鳢血浆生化指标的影响

由表5可知，饲料中添加0.60% Arg或0.03% NCG对杂交鳢血浆TP、TG、GLU、UN、TC含量及AST、ALT活性均无显著影响(P>0.05)。

表5 饲料添加Arg和NCG对杂交鳢肠道消化酶活性及功能性指标的影响

2.4 饲料添加Arg和NCG对杂交鳢肠道消化酶活性及功能性指标的影响

由表6可知，与对照组相比，饲料中添加0.60% Arg显著增加了杂交鳢肠道蛋白酶、LPS、AMS和γ-GT活性(P<0.05)。与对照组和0.60% Arg组相比，饲料中添加0.03% NCG显著提高了杂交鳢肠道AMS活性(P<0.05)。饲料中添加0.60% Arg或0.03% NCG对杂交鳢肠道Na+/K+ATPase酶活性无显著影响(P>0.05)。

表6 饲料添加Arg和NCG对杂交鳢血浆抗氧化指标的影响

2.5 饲料添加Arg和NCG对杂交鳢血浆抗氧化指标的影响

由表7可知，与对照组相比，饲料中添加0.60% Arg显著提高了杂交鳢血浆T-AOC(P<0.05)。与对照组和0.60% Arg组相比，饲料中添加0.03% NCG显著提高了杂交鳢血浆POD活性(P<0.05)。0.60% Arg组杂交鳢血浆POD活性与对照组之间没有显著差异(P>0.05)。与0.60% Arg组相比，饲料中添加0.03% NCG显著提高了杂交鳢血浆CAT活性(P<0.05)。饲料中添加0.60% Arg或0.03% NCG对杂交鳢SOD、GSH-Px活性及MDA含量无显著影响(P>0.05)。

表2 饲料添加Arg和NCG对杂交鳢生长性能及形态学指标的影响

3 讨 论

由于水生动物鸟氨酸转羧化酶(OTC)、氨甲酰磷酸合成酶(CPS)Ⅲ的活性偏低，因此，必需外源补充Arg以满足鱼类生长和代谢所必需[1]。Arg可激活雷帕霉素靶蛋白(TOR)信号通路调节蛋白质合成，参与鸟氨酸循环，促进蛋白质在体内沉积，提高机体生长性能[18]。水生动物缺乏Arg会导致生长迟缓、免疫神经受损、营养障碍性疾病等[19]。在本试验条件下，饲料添加0.03% NCG对杂交鳢WGR及SGR没有显著影响，但添加0.60% Arg使饲料Arg含量达到2.92%，可显著提高杂交鳢WGR及SGR，可能由于杂交鳢对NCG合成的内源Arg利用效率低于饲料添加的Arg。但饲料中添加Arg和NCG可降低FCR，提高PDR。这表明外源添加Arg或NCG都可提高机体蛋白质沉积，提高生长效率。在本试验条件下，与对照组相比，饲料中添加Arg和NCG可提高PDR，并且提高杂交鳢鱼体CP含量，但对全鱼水分、EE、CF含量没有显著影响，说明适量添加Arg可有效促进鱼体蛋白质沉积，促进氨基酸吸收利用，提高肌肉品质。NCG作为NAG类似物，由于NAG易降解，NCG不易降解，并且与直接添加Arg相比，可降低饲料成本，提高代谢相对稳定性[13]。目前，在水产动物中关于Arg和NCG的应用研究效果较缺乏，并且在研究中还要考虑到添加量、试验动物种类以及实际生产成本等因素。

血浆生化指标直观反映鱼体健康水平、代谢能力及机体内环境稳态，也可反映机体病理变化[20]。在本研究中，杂交鳢血浆TP、TG、GLU、UN、TC含量及AST、ALT活性各组间均无显著差异，表明外源添加Arg或内源合成途径并未对杂交鳢机体产生不良影响。

肠道作为运输、消化食物的主要场所，是一个复杂的多功能器官，同时也是抵御病原微生物入侵的防线，对鱼类生长及健康非常重要[21]。本试验中，与对照组及0.60% Arg组相比较，饲料添加0.03% NCG显著增加了杂交鳢肠道AMS活性，饲料添加Arg可显著提高仿刺参蛋白酶活性[22]，显著提高建鲤蛋白酶及LPS活性[23]，与本试验研究结果相同，但NCG在水产动物消化方面研究相对较少。本试验结果表明，在饲料中添加Arg可显著促进营养物质交换，提高杂交鳢肠道酶活性及能量转化效率，但Arg代谢物多胺可作用于细胞增殖分化，同时保护肠道的完整性[24]，Arg在促进营养物质消化吸收方面的作用不仅取决于消化酶的活性，还可能与其代谢产物如一氧化氮或多胺有关。研究显示，饲料补充NCG可促进罗非鱼脂肪沉积[16]，显著提高黄颡鱼肠道LPS活性[25]，显著提高大菱鲆PDR[11]，显著提高花鲈PDR，减少肝腹脂沉积[15]。本试验结果表明，添加Arg提高肠道蛋白酶活性，作用于机体蛋白质合成，促进机体生长，但NCG只显著提高了肠道AMS活性，与上述研究结果不一致，原因可能由于内源性合成Arg利用效率低，或与添加量及动物种类相关联。

在水生动物中，机体抗氧化防御系统通过清除体内外氧自由基，减少内外环境因素造成的氧化应激，保护机体免受氧自由基损伤，其中抗氧化酶的保护机制主要与清除ROS相关，抗氧化防御系统由SOD、GSH-Px、T-AOC等组成，调节机体氧化平衡[26-27]。在本试验条件下，与对照组相比，饲料添加0.60% Arg显著增强了杂交鳢血浆T-AOC，T-AOC是机体抗氧化能力的综合指标，直接参与并反映机体受外部刺激及氧自由基代谢的能力。与0.60% Arg组相比，0.03% NCG组显著提高杂交鳢血浆CAT及POD活性，NCG的抗氧化活性效果要优于Arg。

4 结 论

综上所述，饲料中添加0.60% Arg或0.03% NCG均能显著增强杂交鳢PDR、鱼体CP含量、肠道LPS及γ-GT活性、血浆T-AOC。而饲料中添加0.03% NCG显著提高了杂交鳢血浆CAT、POD活性。在本试验条件下，饲料中添加Arg在生长性能上优于NCG，但对抗氧化能力而言，饲料中添加NCG效果优于Arg。