HET0016通过抑制创伤性颅脑损伤后的过度自噬减轻脑损伤

史英武，吴 勋，屈 延，葛顺楠

(空军军医大学唐都医院神经外科，陕西 西安 710038)

创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)具有高致死率和致残率的特点[1]，减轻脑外伤后继发性脑损伤，促进神经功能恢复，是减轻患者家庭和社会负担、提高患者生活质量的关键[2]。20羟基二十碳四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE)是花生四烯酸在细胞色素酶作用下的代谢产物[3]。脑卒中患者血浆中20-HETE水平升高，并且与不良预后相关，表明20-HETE水平可能是脑卒中患者预后不良的危险因素[4]，但在TBI患者中20-HETE是否发挥作用仍然不清楚。

自噬是细胞内高度保守的自我降解过程，可参与多种生理或病理过程。一方面 ，生理水平的自噬可以清除体内多余的蛋白质，另一方面，过度自噬会干扰细胞正常的生理过程，甚至导致细胞死亡[5]。近年来自噬的分子机制和生理功能在各类疾病中逐步得到阐明，但TBI中过度自噬是否与脂质代谢产物相关的研究仍未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料

雄性C57BL/6小鼠购自空军军医大学实验动物中心，8～12周龄，体质量20～25 g，在恒温室内进行12 h光照/12 h黑暗循环饲养1周，自由获得食物和水。本实验使用了36只小鼠，随机分为3组：假手术组(Sham组)、TBI组和TBI+HET0016(20-HETE清除剂)组，每组12只小鼠。所有实验均按照美国国立卫生研究院发布的《实验动物护理和使用指南》进行，并得到空军军医大学伦理委员会的批准(许可证号：TDLL2017-03-190)。

1.2 方法

1.2.1 TBI造模 通过可控皮质冲击法液压装置进行TBI造模。具体方法如下：采用50 g/L水合氯醛深度麻醉小鼠后，沿正中位置纵向剪开头顶部皮肤，随后用颅钻在前囟向后1.5 mm、中线向右1.5 mm处开一直径为2 mm的骨窗，然后将液压冲击器的冲击管口小心放置在骨窗内，打击速度3 m/s，深度1.8 mm，停留时间为2 s。打击结束后用骨蜡封闭骨窗，缝合伤口皮肤并消毒。Sham组小鼠接受开颅术而不接受皮质打击。TBI模型小鼠随机分为TBI组和TBI+HET0016组，在模型建立后2 h，TBI+HET0016组小鼠接受1.5 mg/kg的HET0016治疗[6]。

1.2.2 ELISA 用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10 mg/L，每孔加0.1 mL，4 ℃过夜。24 h后加待检样品0.1 mL于上述已包被的反应孔中，37 ℃下孵育1 h，洗涤。反应孔中加入新鲜稀释的酶标二抗抗体0.1 mL，37 ℃下孵育30 min，洗涤。加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB 底物溶液0.1 mL，37 ℃下孵育10～30 min。终止反应：于各反应孔中加入2 mol/L硫酸0.05 mL。结果采用酶标仪进行判定，于450 nm处进行读数并绘制标准曲线，依照标准曲线测量样品数值，从而得出样品含量。

1.2.3 小鼠神经功能缺损评分 TBI模型建立24 h后进行小鼠神经功能缺损评分，具体评分项目包括：出圈、偏瘫、直线行走、惊吓反射、探究行为、方杆平衡、圆杆平衡、方杆行走。上述任务完成计0分，失败计1 分，总分为8分，评分越高，提示神经功能损伤越重。

1.2.4 小鼠脑含水量测定 用50 g/L水合氯醛深度麻醉小鼠后采用断颈法处死，迅速于冰上分离大脑。收集大脑皮层，并用滤纸吸干以除去表面血液和脑脊液。用分析天平测量皮层湿质量。随后将皮层置于烤箱中，于100 ℃烘烤24 h，以获得干质量。大脑水肿程度用脑含水量=(湿质量-干质量)/湿质量× 100%计算。

1.2.5 TUNEL染色 小鼠经50 g/L水合氯醛腹腔麻醉后，经心脏灌注取脑，固定脱水后冰冻切片(厚度35 μm)；切片常规漂洗3次，每次10 min，滴加新配的蛋白酶K工作液20 mg/L，室温孵育10 min;按照试剂盒说明配制TUNEL检测液(Roche公司)，在小鼠脑组织切片上滴加适量检测液，37 ℃孵育60 min;滴加DAPI染液室温避光孵育10 min，使用抗淬灭剂封片，在激光共聚焦显微镜下观察结果。以上各步骤间均用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次10 min。

1.2.6 免疫荧光染色 小鼠经50 g/L水合氯醛腹腔麻醉后，灌注取脑，固定脱水后冰冻切片(厚度35 μm)；切片常规漂洗3次，每次10 min，然后用3 mg/L Triton X-100通透20 min，使用20 g/L BSA常温孵育切片60 min。将切片置于兔抗LC3抗体(1∶400，CST公司)中4 ℃孵育过夜；常规漂洗后加入Alexa 488标记的驴抗兔IgG抗体(1∶400，CST公司)，室温孵育4 h；然后将切片加入DAPI (1∶1 000)中孵育10 min，PBS漂洗后裱片，风干后用荧光封片剂封片，用激光共聚焦显微镜观察LC3在损伤周边皮质的表达。以上各步骤间均用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次10 min。

2 结果

2.1 TBI后脑组织中20-HETE表达上升

小鼠损伤周边皮质ELISA结果显示，Sham组、TBI组和TBI+HET0016组20-HETE的表达水平分别为(3.34±2.08)、(20.67±3.78)和(9.30±1.23)μg/g。统计分析显示相对于Sham组，TBI组中20-HETE的表达水平显著升高(P<0.01)；相对于TBI组，TBI+HET0016组中20-HETE的表达水平显著降低(P<0.01)。

2.2 20-HTET清除剂可以减轻TBI小鼠神经功能异常和脑水肿

神经功能学评分结果显示，Sham组、TBI组和TBI+HET0016组评分分别为(1.13±0.79)、(6.00±1.23)和(3.21±1.15)分。统计分析显示，相对于Sham组，TBI组中神经功能学评分显著升高(P<0.01)；相对于TBI组，TBI+HET0016组中神经功能学评分显著降低(P<0.05)，提示TBI小鼠接受20-HETE治疗可以显著减轻神经功能障碍。脑含水量测定结果显示，Sham组、TBI组和TBI+ HET0016组脑含水量分别为(71.64±1.53)%、(87.20±2.33)%和(73.51±1.67)%。统计分析表明，相对于Sham组，TBI组中脑含水量显著升高(P<0.01)；相对于TBI组，TBI+HET0016组中脑含水量显著降低(P<0.01)，提示脑水肿减轻。

2.3 20-HETE清除剂可以减轻创伤脑组织周围的细胞凋亡

TUNEL染色结果显示Sham组、TBI组和TBI+ HET0016组损伤周边的凋亡细胞数目分别为(5±3)、(125±15)和(49±10)个/mm2。统计分析显示相对于Sham组，TBI组小鼠损伤周边皮质的凋亡细胞数目显著上升(P<0.01)，在接受HET0016治疗后，TBI小鼠损伤周边组织的凋亡细胞数目显著降低(P<0.01)，提示抑制20-HETE的表达可以减轻损伤周边的凋亡水平(图1)。

A：Sham组；B：TBI组；C：TBI +HET0016组。Sham：假手术；TBI：创伤性颅脑损伤。TUNEL ×50。图1 小鼠损伤周边皮质的TUNEL染色

2.4 20-HETE清除剂可以减轻创伤脑组织周围LC3的表达

免疫荧光结果显示Sham组、TBI组和TBI+HET0016组损伤周边的LC3阳性细胞数目分别为(2.67±1.82)、(72.33±12.5)和(16.67±3.05)个/mm2。统计分析显示，相对于Sham组，TBI组小鼠LC3阳性细胞数目显著上升(P<0.01)，在接受HET0016治疗后，TBI小鼠损伤周边组织LC3阳性细胞数目显著降低(P<0.01)，提示抑制20-HETE的表达可以减轻损伤周边自噬水平(图2)。

LC3：微管相关蛋白轻链3；Sham：假手术；TBI：创伤性颅脑损伤。×200。图 2 小鼠损伤周边皮质的LC3(绿色)与细胞核(蓝色)的免疫荧光染色

3 讨论

TBI是一种严重的全球性疾病，具有高致死率和高致残率的特点，在损伤急性期会引起损伤周边皮质广泛的神经元凋亡，在损伤慢性期会导致全脑的病理变化从而引起继发性脑损伤。目前针对TBI急性期患者的治疗主要是通过手术治疗来减轻血肿和降低颅内压，但是手术治疗只能挽救患者的生命，对于损伤周边皮质神经元死亡造成的长期神经功能损伤，目前仍没有较好的治疗办法。

脑组织在人体各系统代谢中最为旺盛，需要大量的能量供给以维持正常的代谢和电生理活动[7]。20-HETE是花生四烯酸重要的代谢产物之一，在缺血性脑卒中中被证明与炎症反应有关[8]。在TBI中的研究主要集中在损伤线粒体功能和破坏血脑屏障功能等方面[6,9]，其是否与自噬有关还未见报道。本实验结果首先使用ELISA法检测损伤周边皮质20-HETE表达含量的变化，结果证明在TBI后损伤周边皮质20-HETE显著上升，提示20-HETE可能参与了TBI后的病理变化；HET0016与细胞色素酶结合后特异性地抑制20-HETE的合成。在本实验中腹腔注射HET0016也降低了TBI损伤周边皮质20-HETE水平，与预期结果一致。

脑组织水肿是TBI过程中重要的继发性病理变化，是导致长期神经功能缺损的重要原因[10]。在本实验结果中，TBI组小鼠脑组织含水量相对于Sham组显著上升，而TBI小鼠在腹腔注射HET0016后含水量显著降低，提示20-HETE上升可能与TBI导致的脑组织水肿有关，抑制20-HETE可以减轻脑水肿，进而降低神经功能缺损评分，改善TBI导致的神经功能障碍。

在生理条件下，生物体通过细胞凋亡清除体内多余、受损或危险的细胞，并维持基本的细胞功能[11]，TBI后会发生复杂的病理生理变化，损伤周围组织广泛性的细胞死亡是其主要特征[4]，细胞凋亡是这一过程的主要形式。在本实验中，我们采用TUNEL法观察TBI小鼠损伤周围皮质的凋亡细胞数目，结果显示TBI后凋亡细胞的数量显著上升，在TBI小鼠中使用HET0016抑制20-HETE的表达后，可以减轻TBI后损伤周边组织凋亡细胞的数目，提示HET0016具有抑制细胞凋亡的作用。这与之前的一项缺血性细胞模型中的研究结果一致[12]。

自噬是溶酶体降解体内非必需维持的方式[13]，在生理状态下表达水平很低，然而关于TBI后自噬的过程和作用仍缺乏直接证据，有报道称TBI后自噬被过度激活[14]，也有人认为TBI之后自噬通路可能被抑制[15]。目前已有超过30种自噬相关基因被发现，LC3作为自噬检测的标志被广泛应用。细胞凋亡和细胞自噬是哺乳动物清除自身物质的两个重要生理过程，然而过度自噬不能产生细胞保护作用，还会降解细胞核[16]，并引起自噬性细胞凋亡，使细胞损伤加重[17]。本研究首先发现了TBI后损伤周围皮质过度自噬的现象，并首次报道了HET0016具有减轻过度自噬的作用，这为减轻TBI后的细胞凋亡提供了新的思路和靶点。

综上所述，在本实验条件下，HET0016处理可以减低TBI后损伤周边皮质的20-HETE表达水平，缓解脑组织水肿以及神经功能障碍，机制研究表明，降低20-HETE表达可缓解TBI导致的过度自噬，并减轻损伤周围皮质的细胞凋亡。