卵裂期冷冻与囊胚期冷冻的单囊胚移植临床结局比较

毕钡钡，付琬婷，代玮，石森林，史昊，胡琳莉

(郑州大学第一附属医院生殖医学中心，郑州 450052)

随着胚胎冻存技术的发展，冻融胚胎移植(FET)在辅助生殖技术(ART)中的应用越来越广泛。玻璃化冷冻作为ART中更有效和安全的胚胎冻存方式，应用于卵裂期和囊胚期的胚胎冻存，均能获得理想的实验室指标和临床结局[1]。随着生育政策的调整，不孕夫妇二胎的需求逐渐增加，对于新鲜周期获卵数较多的夫妇，其二胎冻融周期可供选择的移植策略包括冻融卵裂期胚胎移植、冻融卵裂期胚胎后囊胚培养移植和冻融囊胚移植。与卵裂期胚胎相比，囊胚的种植率更高，单囊胚移植不仅提高了妊娠率，而且降低了双胎或多胎妊娠的风险，更好地保证了母婴安全[2]。一些研究比较了卵裂期胚胎解冻复苏后行囊胚培养后移植与冻融单囊胚移植的临床结局，结果显示冻融卵裂期胚胎后囊胚培养移植有更高的着床率、临床妊娠率和活产率[3-5]，但这些研究均未关注其来源胚胎的等级和养成囊胚的等级。由于不同形态学等级的卵裂期胚胎囊胚培养的形成率不同[6]，移植不同等级的囊胚临床结局也不同[7-8]。本研究旨在比较优质卵裂期胚胎解冻复苏后行囊胚培养移植与常规冻融单囊胚移植的实验室指标及临床结局，为临床冷冻移植策略提供更多的选择。

资料和方法

一、研究对象

回顾性分析2017年1月至2020年12月在郑州大学第一附属医院生殖医学中心行卵裂期胚胎解冻复苏后囊胚培养再移植患者及冻融单囊胚移植患者的临床资料。

纳入标准：(1)D3胚胎形态学评级为Ⅱ级及以上优质胚胎的移植周期；(2)行单囊胚移植。

排除标准：(1)孕妇年龄≥40岁；(2)女方供卵、胚胎植入前遗传学诊断(PGD)、反复流产、染色体异常；(3)合并子宫疾病：子宫畸形、宫颈功能不全、宫腔粘连、子宫内膜异位症；(4)低扩张囊胚(≤2BB)；(5)Ⅲ级及以下评分的卵裂期胚胎；(6)玻璃化冷冻2次及以上的胚胎。

本研究共纳入957例患者，每例患者均只有一个周期被纳入研究。根据胚胎的冷冻时机，分为卵裂期冷冻组(112例)和囊胚期冷冻组(845例)。通过倾向性评分匹配对两组患者进行1∶1匹配，匹配变量包括孕妇的年龄、不孕年限、不孕症类型、受精方式、基础抗苗勒管激素(AMH)水平和囊胚质量，匹配后产生卵裂期冷冻组(n=79)和囊胚期冷冻组(n=79)。

二、研究方法

1.囊胚培养及评分：胚胎质量通常使用静态形态学标准进行评估。所有卵裂期胚胎都在第3天进行分级，基于细胞数量、密度和碎裂程度，优质卵裂胚胎(Ⅰ级或Ⅱ级)指第3天细胞数超过6个、破碎率<20%、细胞对称(细胞大小相同)、无多核[9-11]。囊胚根据Gardner标准进行分级，分级标准基于囊胚的扩张、内细胞团(ICM)的发育和滋养外胚层(TE)的外观[7，9]。可移植囊胚是指D5或D6的囊胚，内细胞团(ICM)或滋养外胚层(TE)至少有一项评分B；根据囊腔扩张程度、ICM和TE，将评分3BB及以上(AA/AB/BA/BB级)定义为优质囊胚。

2.囊胚的冷冻复苏、内膜准备及囊胚移植：玻璃化冷冻和解冻复苏方案以及子宫内膜准备均按照本中心的常规操作流程[12]。

3.观察指标：两组患者的基本资料，包括年龄、BMI、不孕年限、不孕类型、受精方式、AMH水平以及基础FSH；实验室胚胎发育指标，包括内膜准备方案、囊胚形成情况、移植胚胎时机以及着床率；临床妊娠结局，包括临床妊娠率、流产率、异位妊娠率及活产率。囊胚形成率=可移植囊胚数/行囊胚培养的总优质卵裂期胚胎数×100%；优质囊胚形成率=优质囊胚数/可移植囊胚数×100%；着床率=孕囊数/移植胚胎数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；流产率=流产周期数/移植周期数×100%；异位妊娠率=异位妊娠周期数/移植周期数×100%；活产率=活产周期数/移植周期数×100%；多胎妊娠率=多胎妊娠周期数/移植周期数×100%。本研究中流产率、异位妊娠率、多胎率的计算均以平均每移植周期的比率来表示。

三、统计学分析

结 果

一、两组患者囊胚形成情况

实验室结果显示，卵裂期冷冻组的囊胚形成率与囊胚期冷冻组比较无显著差异(P>0.05)；卵裂期冷冻组的D5囊胚形成率(62.8% vs.69.3%)、优质囊胚形成率(31.6% vs.49.9%)均显著低于囊胚期冷冻组(P<0.05)；卵裂期冷冻组的D6囊胚形成率显著高于囊胚期冷冻组(37.2% vs.30.7%，P<0.05)。

表1 两组患者囊胚形成情况比较(%)

二、两组患者基本资料

匹配前卵裂期冷冻组患者的平均年龄、不孕年限、继发不孕占比均显著高于囊胚期冷冻组(P<0.05)，而IVF的占比、AMH水平、优质囊胚占比显著低于囊胚期冷冻组(P<0.05)；两组的体质量指数(BMI)、基础促卵泡生成素(bFSH)、移植囊胚发育天数以及子宫内膜准备方案的差异均无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 两组患者匹配前基本情况比较

经PSM匹配和SMD平衡评估后，两组患者均为79例，且两组间有差异的基线资料，包括平均年龄、不孕年限、不孕类型、受精方式、基础AMH水平、移植囊胚评分均得到平衡(SMD绝对值<0.1)；匹配后两组间的全部基线资料均无显著性差异(P>0.05)(表3)。

表3 两组患者匹配后基本情况比较

三、两组患者妊娠结局比较

匹配前，两组患者的临床妊娠率、着床率、活产率、异位妊娠率、流产率、多胎率均无显著性差异(P>0.05)(表4)。然而，当进行PSM匹配后，与囊胚期冷冻组相比，卵裂期冷冻组的活产率显著升高、流产率显著下降(P<0.05)；两组患者的临床妊娠率、着床率、异位妊娠率、多胎率比较仍均无显著性差异(P>0.05)(表5)。

表4 两组患者匹配前妊娠结局的比较(%)

表5 两组患者匹配后妊娠结局的比较(%)

讨 论

随着ART和胚胎冻存技术的发展，各中心冻存的卵裂期胚胎逐年增多；在适应生育政策的调整下，不孕夫妇的二胎甚至三胎的需求也逐渐增多。冻融周期对冻存的卵裂期胚胎的利用也成为临床医生在临床策略决定中重要的部分。本中心对于新鲜周期获得多个卵裂期胚胎的患者，常规冷冻策略是将大多数卵裂期胚胎(优质和劣质)行囊胚培养后冷冻，同时留下少量优质卵裂期胚胎直接冷冻。冷冻的可移植囊胚和优质卵裂期胚胎用于后续的冻融周期。当患者存在子宫疤痕且仅剩冷冻的卵裂期胚胎时，后续冻融周期会选择同时解冻复苏多个卵裂期胚胎行囊胚培养后进行单囊胚移植。比较解冻复苏的卵裂期胚胎行囊胚培养移植与常规冻融单囊胚移植在实验室指标和临床结局上的差异是本研究的目的。

在本研究中，所有的胚胎都是采用玻璃化冷冻方法保存的。与传统的慢速冷冻方法相比[16]，胚胎玻璃化冷冻作为一种超快速冷冻保存方法，能够避免细胞冻存时生成的结晶对细胞的损伤[14，17]；无论冻存卵裂期胚胎还是囊胚期胚胎，玻璃化冷冻均能确保胚胎非常高的存活率[1]。动物研究发现，新鲜卵裂期的小鼠胚胎和经过玻璃化冻融的小鼠胚胎发育成的囊胚在基因表达上没有显著差异[18]。我们的临床结果与上述研究相一致，解冻复苏优质卵裂期胚胎行囊胚培养的囊胚形成率与新鲜周期的优质卵裂期胚胎行囊胚培养相比无统计学差异。尽管玻璃化冷冻是一种相对安全的冷冻方法，但冷冻保存对胚胎的毒性效应不容忽视[14]。冷冻保护剂本身具有细胞毒性，并可能渗透或直接造成细胞损伤[19-20]。本研究的结果也进一步体现出冷冻过程对胚胎的影响，解冻复苏的优质卵裂期胚胎的D5囊胚形成率和优质囊胚形成率均低于未经过冷冻的新鲜周期优质卵裂期胚胎。

为了保证临床资料的有效及结果的可靠性，我们对纳入的研究对象进行了倾向性评分匹配，并对匹配前后基线资料的差异性进行了SMD值的统计，匹配后的SMD值均小于0.1，使得两组间的变量得到有效均衡。

囊胚的形态学评分在一定程度上与妊娠结局存在相关性[6-7，21]。本研究中匹配前囊胚期冷冻组更多的优质囊胚并没有获得更高的活产率，而匹配相同等级评分的囊胚后，囊胚期冷冻组的活产率却显著低于卵裂期冷冻组，这一结果与既往的研究相一致[4-5]。同时本研究卵裂期冷冻组的流产率更低。可能的原因为，解冻复苏后的卵裂期胚胎发育为囊胚的过程，一定程度上对胚胎进行了自然选择，从而筛选出更具有发育潜能的胚胎，而这种选择无法通过胚胎学家在形态学上的区分解释。另一方面，胚胎发育的过程发生细胞周期及DNA损伤等的修复[22]，当卵裂期胚胎发育为囊胚的过程发生于胚胎冻融程序之后，胚胎的发育则可能在一定程度上修复冷冻对胚胎产生的伤害[4，23]。国内研究发现，解冻复苏卵裂期胚胎培养至囊胚后移植与冻融卵裂期胚胎直接移植相比，减少了患者平均移植胚胎数且妊娠结局无显著差异[24]，但该研究的移植胚胎处于不同的发育阶段，且胚胎冻存使用慢速冷冻法可能增加对胚胎的伤害。

本研究也存在一些局限性，首先，胚胎和囊胚的分级是通过人为观察进行的。第3天卵裂期胚胎和囊胚的形态学判定是主观的，临床工作中不可避免地会出现差异[25]。然而，此种人为的差异在日常工作中会分布至每一位患者中，因此可以得到一定程度的均衡。其次，作为一项回顾性研究，回顾性数据的弊端不可避免，因此我们进行了匹配以平衡误差，但这种方法也会导致样本量的减少。另外，本研究未统计两组的累计临床妊娠情况，不能反映整个周期的移植效果，未来需要更多的前瞻性研究以及累计妊娠结局的观察，来综合评价该策略的有效性，为不孕夫妇提供更高效的移植策略。

尽管解冻复苏优质卵裂期胚胎后囊胚培养的临床样本尚少，本研究结果显示，解冻复苏后的优质卵裂期胚胎培养为囊胚的囊胚形成率不低于新鲜优质卵裂期胚胎，且临床结局优于冻融单囊胚移植，增加活产率的同时，降低了胚胎流产率，提高了种植效率。因此，对于冻存有优质卵裂期胚胎、子宫有疤痕的不孕夫妇，二胎或三胎的冻融周期选择解冻复苏优质卵裂期胚胎行囊胚培养是值得考虑的临床策略之一。