基于日本假单胞菌超声破碎液对新疆乌东低阶煤的降解

吴 昊，刘向荣，2，石 晨，杨 杰，赵顺省,2，杨再文,2

(1.西安科技大学 化学与化工学院，陕西 西安 710054；2.自然资源部煤炭资源勘察与综合利用重点实验室，陕西 西安 710021)

低阶煤水分高、灰分大，直接燃烧热值低，且污染环境，而传统的加工方法，如气化、液化和热解等方式存在工艺条件苛刻，能耗高等缺点。低阶煤的微生物降解在常温、常压下进行，不产生大气污染物，是低阶煤绿色转化的有效途径之一。

煤的微生物降解起源于20世纪80年代，COHEN和GABRIELE是该领域研究的先驱者，他们发现了真菌和可将固体褐煤降解为黑色液滴，之后引起了国内外学者的广泛关注。煤的微生物降解初期，主要是利用微生物细胞培养液直接与煤接触，使煤降解。随着降解研究的深入，研究者们逐渐认识到细胞分泌液即胞外液是煤微生物降解的主要物质，从而进行了利用微生物胞外液降解煤的研究。COHEN等将通过0.45 μm孔径过滤器获得胞外液，并对风化褐煤进行了降解，发现降解率较细胞培养液明显提高；LABORDA等对真菌M2进行了离心并使用0.45 μm和0.20 μm的膜对其进行过滤获得胞外液，降解了煤阶较高的硬煤和次烟煤；YANG等对细菌P6进行了离心并通过Whatman No.1滤纸过滤，获得胞外液，并对胞外液中酯酶进行了提取和纯化，发现纯化酯酶对煤样降解效果远高于细胞培养液。由此可见，利用微生物胞外液及纯化酶代替细胞活体进行煤的生物降解，可提高煤的降解率，然而，它们的获取需经离心、微膜过滤和盐析等方法，耗时长、处理量低且操作复杂，不利于工业化应用。为了提高煤的微生物降解效果，简化降解工艺，促进工业应用，笔者团队萌生了利用超声波破碎微生物细胞，直接用超声破碎液代替传统细胞培养液及胞外液降解煤的想法，探讨简化处理工艺后的降解效果。笔者选择文献报道中对低阶煤降解能力较好的日本假单胞菌作为实验菌种，利用日本假单胞菌的超声破碎液对煤样进行降解，同时以未经处理的细胞培养液作对比，研究超声破碎液对煤样的降解效果及工艺条件，确定菌种的最佳破碎区间，分析超声破碎液的组成。分析日本假单胞菌超声破碎液降解煤样的固、液相产物，探讨煤样降解前后的变化与液相产物的组成。

1 实 验

1.1 煤样的制备

实验所用煤样为新疆乌东煤矿低阶煤，利用球磨机将其破碎并进行筛分，获得粒径为0.25～0.50 mm的样品，用8 mol/L的硝酸对原煤氧化48 h，并用去离子水洗涤至中性，烘干、灭菌备用。日本假单胞菌超声破碎液降解新疆乌东低阶煤的研究思路如图1所示。原煤及氧化煤的元素分析与工业分析见表1。

图1 日本假单胞菌超声破碎液降解乌东低阶煤研究思路

表1 煤样元素分析与工业分析

由表1可看出，原煤经硝酸氧化后，C，H，S质量分数降低，O，N质量分数增加，灰分降低，挥发分升高，这是由于硝酸与煤样反应，使芳香环羧基化、侧链烷基氧化及硝化，且煤中的无机物被硝酸溶解，使煤样灰分降低。

1.2 微生物的培养及生长曲线的测定

1.2.1 微生物的培养

日本假单胞菌()购买于中国微生物菌种保藏中心(CICC)，编号为CICC 23895，属革兰氏阴性菌，有极性丛生鞭毛，不形成孢子，棒状，大小(2.0～3.5)μm×(1.3～1.7)μm，可以产蛋白酶、酯酶、脂肪酶、酸性磷酸酶等。

培养基采用CICC所提供的牛肉膏培养基配方：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，氯化钠 5 g，琼脂20 g，去离子水1 L。将菌种接种于50 mL液体培养基，置于150 mL锥形瓶内进行培养，条件为恒温30 ℃，160 r/min振动培养。

1.2.2 生长曲线的测定

采用北京普析通用仪器有限责任公司TU1950型紫外可见分光光度计(UV-Vis)测定日本假单胞菌细胞培养液在600 nm处的光密度(OD)。以菌种的培养时间为横坐标，光密度为纵坐标作图，即得菌种的生长曲线。

1.3 日本假单胞菌超声破碎液、胞内及胞外液的获取及分析方法

1.3.1 超声破碎液的获取及分析

(1)超声破碎液的获取。利用宁波新芝生物科技股份有限公司JY92-ⅡN型超声波细胞粉碎仪(电压220 V，频率20～25 KHz，功率0～600 W，变幅杆6 mm，破碎容量0.5～500.0 mL)对日本假单胞菌在培养基中进行超声波细胞破碎，超声波细胞破碎工作参数为功率400 W，辐射时间5 s，间隔时间5 s，总时间30 min，菌种破碎体积50 mL，这是根据单因素和正交试验确定的。工作结束后，获得超声破碎液，包含胞外液和胞内液。

(2)超声破碎液的分析。称取200 mg溴化钾进行压片，使用移液枪量取25 μL日本假单胞菌超声破碎液，均匀滴至溴化钾片表面，采用美国Thermo Fisher Scientific公司Nicolet iN10 & iZ10傅里叶红外光谱仪(FTIR)在4 000～400 cm内，分辨率4 cm，进行红外光谱扫描。

通过三氯甲烷溶剂萃取法对日本假单胞菌超声破碎液进行萃取，分液后收集下层三氯甲烷萃取液，利用美国Agilent公司8890-5977B型气相色谱质谱联用仪(GC-MS)进行分析。

1.3.2 胞内、胞外液的获取及分析

(1)胞内、胞外液的获取。胞外液的获取：对日本假单胞菌进行离心(离心条件为4 ℃，10 000 r/min，20 min)，收集上清液并通过0.22 μm PES膜注射器过滤，获得胞外液。胞内液的获取：对日本假单胞菌进行离心(离心条件同上)收集菌体沉淀，利用pH=7.2的磷酸盐缓冲液对菌体沉淀洗涤3～5次后进行超声波细胞破碎(超声波细胞破碎工作参数同上)，工作结束后离心(离心条件同上)取上清液并通过0.22 μm PES膜注射器过滤，获得胞内液。

(2)胞内、胞外液的分析。胞内、胞外液的FTIR和GC-MS的制样与测试方法同超声破碎液。

1.4 日本假单胞菌超声破碎液对煤样的降解实验

在150 mL锥形瓶内，加入50 mL的日本假单胞菌超声破碎液及0.3 g灭菌煤样于恒温30 ℃、160 r/min的振动培养箱内进行降解实验，降解结束后，对所得产物进行离心(离心条件为8 000 r/min，20 min)获取固相产物和液相产物，固相产物用去离子水洗涤、干燥(80 ℃)，称其质量，并计算降解率。

利用日本假单胞菌超声破碎液对煤样进行降解实验，并以菌种细胞培养液(即菌液)作为对照，考察煤样降解效果与降解时间的关系及2者降解产物的差异。

1.5 日本假单胞菌对煤样降解效果的评价

利用2种方法对煤样降解效果进行评价，吸光光度法与计算法。

(1)吸光光度法。煤样经生物降解后，类腐殖酸物质溶解至培养基中，在450 nm波长下有最大吸光度值，与煤样的降解率成正比。因此，利用紫外可见分光光度计(UV-Vis型号同1.2.2)测定液相产物(稀释30倍)在450 nm波长下的吸光度()，用于评价煤样的降解效果。

(2)计算法。对煤样降解前后的质量进行称量，利用式(1)计算其降解率：

(1)

式中，为生物降解效率，%；为煤初始质量，g；为煤生物降解后质量，g。

1.6 降解固液相产物的分析

(1)固相产物分析。利用傅里叶红外光谱仪(型号同1.3.1节)，采用定量溴化钾压片法(固相产物∶KBr(质量比)=1∶200，对固相产物进行红外光谱扫描，扫描条件同1.3.1节。使用日本Rigaku公司 Mini Flex 600 X-射线衍射仪对固相产物进行分析，扫描范围为5°～80°，扫描速度为2(°)/min。采用美国Micromeritics公司ASAP 2020物理吸附仪(氮气)对固相产物的孔径分布及比表面积进行测定。

(2)液相产物分析。选用甲苯和乙酸乙酯对液相产物进行萃取，萃取物进行旋蒸去除水分，并分别使用相应有机溶剂稀释，然后采用气相色谱质谱联用仪(GC-MS型号同1.3.1节)进行分析。

2 结果与分析

2.1 日本假单胞菌的生长曲线

日本假单胞菌的生长曲线如图2所示，可分为4个阶段：迟缓期(0～3 h)、对数期(3～60 h)、稳定期(60～84 h)和衰亡期(84～160 h)。菌种处于迟缓期时，为适应培养基环境，生长极为缓慢，曲线较为平缓；处于对数期时，细胞数量快速上升并逐渐趋于稳定，此时菌种活性最高；处于稳定期时，由于培养基中养分的消耗及细胞内毒性物质的积累等因素，导致细菌生长繁殖速度下降，衰亡速度开始增加，使该阶段菌种细胞总数与代谢产物含量均处于平衡状态；菌种处于衰亡期时，其繁殖速度继续下降，细胞死亡数量大量增加，生长代谢趋近于停滞状态。

图2 日本假单胞菌生长曲线

2.2 日本假单胞菌最优破碎期

日本假单胞菌不同生长时期的超声破碎液对煤样的降解效果如图3所示，相同培养时间的菌种细胞培养液对煤样的降解效果也呈现在图3，可以看出随菌种培养时间的增加，超声破碎液和细胞培养液对煤样的降解效果都是先提高后达到稳定，前者的降解效果普遍比后者高，在菌种培养60 h后，超声破碎液和细胞培养液对煤样的降解效果同时达到稳定。由图2可知，菌种生长状态从稳定期起，对煤样降解效果便达到稳定。

图3 日本假单胞菌不同生长时期的超声破碎液对煤样的降解效果

因此，本文选用培养60 h(稳定期)的日本假单胞菌，进行超声波细胞破碎获取超声破碎液，以相同培养时间菌种细胞培养液作为对照，研究超声破碎液对煤样降解过程的影响。

2.3 日本假单胞菌超声破碎液、胞内及胞外液组成

2.3.1 日本假单胞菌超声破碎液FTIR分析

日本假单胞菌胞内胞外液的FTIR分析如图4所示，可看出超声破碎液、细胞培养液、胞外液和胞内液的红外光谱相似，表明其所含物质官能团相似。图4中2 925 cm处的吸收峰是由—CH—引起的，1 635 cm处的吸收峰是由酰胺带造成的，1 456 cm处的吸收峰是由—CH引起的。

图4 日本假单胞菌超声破碎液、细胞培养液、胞内和胞外液的红外光谱

日本假单胞菌超声破碎液在2 925，1 635及1 456 cm处均存在吸收峰，表明存在—CH—，—CONH及—CH基团。

2.3.2 日本假单胞菌超声破碎液GC-MS分析

日本假单胞菌超声破碎液、细胞培养液、胞内和胞外液总离子流色谱如图5所示。

图5 日本假单胞菌超声破碎液、细胞培养液、胞内和胞外液总离子流色谱

由图5可看出超声破碎液、细胞培养液、胞外液和胞内液组成相似，其中，超声破碎液中物质较为丰富，可能含有环氧乙烷、邻乙基羟胺和丙烷等物质，其官能团—CH—，—CONH，—CH均与图4红外光谱相对应。

日本假单胞菌胞外液和胞内液组成相似，菌种细胞经超声波细胞破碎后，胞内液释放至培养基中，因此增加了培养基中物质的种类和含量。

2.4 日本假单胞菌超声破碎液对煤样的降解率

日本假单胞菌超声破碎液对煤样的降解率如图6所示，可看出超声破碎液和细胞培养液对煤样的降解率随时间变化均表现为先增加，随后达到平稳。超声破碎液和细胞培养液降解煤样的过程均分为3个阶段：快速降解期(2～10 d)，缓慢降解期(10～14 d)和降解平稳期(14～18 d)。14 d时，超声破碎液和细胞培养液对煤样降解率均达到稳定，18 d时降解率分别为48.97%和35.84%。且超声破碎液对煤样的降解率较高，原因是菌种经超声破碎后，胞内液释放至培养基中，与胞外液共同对煤样进行降解，其中，胺类物质显碱性，根据碱性机理，胺类物质可能是煤样降解的主要因素。

图6 日本假单胞菌超声破碎液对煤样的降解率

日本假单胞菌超声破碎液在0～5 h内对煤样的降解率如图6插图所示，可看出煤样降解速率最快的时间段为2.5～3.0，3.0 h时煤样的降解率为12.20%。

煤样降解后液相产物实物如图7所示，可看出液相产物的颜色随时间变化黑色逐渐加深，说明了煤样降解后生成了腐殖酸类等物质。

图7 日本假单胞菌超声破碎液5 h内降解煤样的液相产物

2.5 降解固、液相产物分析

2.5.1 固相产物的FTIR分析

图8 氧化煤和固相产物的红外光谱分析

2.5.2 固相产物的XRD分析

利用X-射线衍射对氧化煤和固相产物进行分析，结果如图9所示，可发现2在24°和43°时，氧化煤、固相产物[1]和固相产物[2]均存在002峰和100峰，分别代表了芳香层片堆砌的高度和芳香环缩合的程度。

由于煤中矿物质的干扰，导致图谱中出现尖锐峰型，图9中002峰是不对称的，归因于002 和γ两种微晶峰叠加而成，因此对其进行分峰拟合，使用布拉格方程和谢乐公式计算得到晶格参数见表2，可以看出，煤样降解后固相产物[1]和固相产物[2]的芳香层片间距增大，堆砌高度变小，碳层数减少，原因可能是煤样分子结构中的含氧官能团、芳香环等结构被降解。从表2可看出，相比对照组固相产物[2]，日本假单胞菌超声破碎液降解煤样所得固相产物[1]的芳香层片间距更大，堆砌高度更小，碳层数更少，说明了超声破碎液对煤样微晶结构的影响更大。

图9 氧化煤和固相产物的XRD分峰拟合

表2 氧化煤及固相产物的微晶结构参数

2.5.3 固相产物的低温N吸附分析

采用低温N吸附对氧化煤和固相产物进行分析，累积吸附表面积见表3，煤样经微生物降解后固相产物[1]和固相产物[2]的BET 比表面积和Langmuir比表面积均增大，可能是由于煤样中的组分被降解，从而增加了比表面积。

表3 煤样累积吸附表面积

图10为煤样孔容孔径分布，可看出氧化煤的比表面积主要是由直径65～1 250 nm孔引起的。经降解后，固相产物[1]和固相产物[2]均产生了新的直径为19～23 nm的微孔，比表面积均增大，从图10中可看出，固相产物[1]在相同直径孔径下的比表面积大于固相产物[2]，其中，固相产物[1]中19～23 nm微孔对应的比表面积增加的最为明显。

图10 氧化煤和固相产物比表面积-孔径分布

然而，日本假单胞菌的大小为(2.0～3.5)μm×(1.3～1.7)μm，大于煤中大部分的孔径，限制微生物进入煤样中，这与YIN等结果一致，表明了日本假单胞菌细胞无法进入孔隙内部对煤样进行降解，这也是菌种细胞培养液对煤样降解效率较低的原因之一。

2.5.4 液相产物的GC-MS分析

日本假单胞菌超声破碎液和细胞培养液降解煤样所得液相产物分别表示为液相产物[1]和液相产物[2]。采用GC-MS对液相产物[1]和液相产物[2]的萃取液进行分析，萃取剂分别为甲苯、乙酸乙酯，总离子流色谱如图11，12所示，可以看出液相产物[1]的物质种类较为丰富。根据仪器本身数据库匹配结果，2种液相产物萃取物均包含烷烃、酯、醇、酮和苯酚类等物质，组成相似，其中液相产物[1]的分子量为154～546，液相产物[2]的分子量为99～546。

对比图5与图11，12，可发现日本假单胞菌细胞所产生的胺类物质经降解反应后消失，且液相产物[1]和液相产物[2]中均出现了类似六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的物质，说明了胺类物质可能参与了煤的降解反应。根据GC-MS分析结果，超声破碎液中存在醇类物质，液相产物GC-MS中存在大量酯类物质，且煤经硝酸氧化后，芳香环或侧链羧基化，由此推测，可能是菌种细胞中产生醇类物质的羟基和煤样分子结构中的羧基进行了酯化反应，生成了酯类物质。

图11 液相产物[1]的萃取液总离子流色谱

GC-MS检测到液相产物[1]和液相产物[2]中均可能含有2,4-二叔丁基苯酚、苯乙醇和邻苯二甲酸二丁酯等物质，它们的官能团分别对应了图8固相产物红外光谱中—OH、脂肪族C—H和—CO—等官能团在3 400，2 920和1 700 cm处吸收峰的降低，说明了煤中的羟基和羧基可能被降解。根据表1元素分析，固相产物中氮元素含量降低，且GC-MS分析表明，液相产物中可能含有2-哌啶酮等含氮元素的物质，说明了煤中含氮类官能团可能被降解。

图12 液相产物[2]的萃取液总离子流色谱

3 结 论

(1)日本假单胞菌在稳定期及稳定期以后进行超声破碎，对煤样有较好的降解效果。培养60 h达到稳定期的菌种超声破碎液，对新疆乌东低阶煤的降解率为48.97%，较对照组提高了13.13%，14 d时降解率达到稳定。其中，降解速率最快的时间为2.5～3.0 h，3 h时，煤样的降解率便达到12.20%。

(2)日本假单胞菌胞内、胞外液组成相似，主要为胺类、醇类和酮类等物质。细胞培养液降解煤样时，主要是胞外液对煤样进行降解，而超声破碎液降解煤样时，是胞内、胞外液共同对煤样进行降解，从而增加了煤样的降解率。

(3)日本假单胞菌超声破碎液降解煤样所得固相产物的分子结构中羟基、羧基及酯基等官能团含量降低；微晶结构中芳香层片的间距增加，堆砌高度降低，碳层数减少；并且固相产物中19～23 nm微孔所对应的比表面积增加。

(4)日本假单胞菌超声破碎液和细胞培养液降解煤样所得的液相产物组成相似，均包含烷烃、醇、酮和酯类等物质，液相产物的分子量分别为154～546和99～546。