基于Box-Behnken响应面法的白芍产地加工与炮制生产一体化工艺研究

张玖捌，张 伟, 2，王 彬，金诗婕，彭瑞潭，毛春芹，王吓长，曹 晖，陆兔林*

基于Box-Behnken响应面法的白芍产地加工与炮制生产一体化工艺研究

张玖捌1，张 伟1, 2，王 彬1，金诗婕1，彭瑞潭3，毛春芹1，王吓长1，曹 晖4，陆兔林1*

1. 南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023 2. 安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012 3. 保和堂（亳州）制药有限公司，安徽 亳州 236800 4. 暨南大学药学院，广东 广州 510632

针对白芍在传统加工炮制过程中成分流失、生产工序重复等问题，利用响应面法优选白芍产地加工与炮制生产一体化（简称“一体化”）工艺。采用Box-Behnken响应面试验设计方法考察白芍一体化工艺中的煮制时间（1）、鲜药材干燥时间（2）、鲜药材干燥温度（3）3个因素，以4种指标性成分（儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、1,2,3,4,6--五没食子酰基葡萄糖）的总评归一值（OD值）作为评价指标，进行一体化工艺优化研究。白芍一体化最佳工艺条件为煮制时间14.11 min，鲜药材干燥时间4.51 h，鲜药材干燥温度52.53 ℃。Box-Behnken响应面法优选白芍一体化工艺切实可行，具有较强的实际意义，为白芍饮片一体化加工生产提供了科学依据。

白芍；Box-Behnken响应面法；产地加工与炮制生产一体化；总评归一值；儿茶素；芍药内酯苷；芍药苷；1,2,3,4,6--五没食子酰基葡萄糖

白芍为毛茛科植物芍药Pall.的干燥根，其味苦、酸，性微寒，归肝、脾经，具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳的功效[1]。现代研究表明，白芍的化学成分主要为单萜苷类（芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷）、三萜类（齐墩果酸、白桦脂酸）、多酚类［（没食子酸、1,2,3,4,6--五没食子酰基葡萄糖（1,2,3,4,6-- pentagalloyl glucose，PGG）］、黄酮类（山柰酚、儿茶素）和多糖类[2]，具有抗炎[3-5]、免疫调节[6-7]、保肝[8-10]、抗抑郁[11-12]等多种药理活性。

《中国药典》2020年版规定白芍的产地加工方法为夏、秋二季采挖，洗净，除去头尾和细根，置沸水中煮后除去外皮或去皮后再煮，晒干。炮制方法为将白芍药材洗净、润透、切薄片、干燥。因此，在白芍传统的加工炮制过程中，产地加工和炮制生产过程相互脱节，白芍需要经过2次完全干燥和反复润制的过程，这不仅导致白芍的生产成本增加、生产效率降低，并且长时间的润制过程易造成芍药苷、芍药内酯苷等有效成分流失[13-14]。白芍产地加工与炮制生产一体化（简称“一体化”）工艺将产地加工与炮制生产2个独立的生产环节由分段模式转变为统一模式，具有摒除重复生产工序、降低加工成本、减少有效成分流失等优势，从而提升饮片质量，保证临床疗效。

响应面法作为一种经典的数学统计方法，其作用在于通过一组确定的试验，拟合成响应面来模拟真实极限状态曲线，并利用多元2次回归方程表征考察因素与响应值之间的关系，从而寻求最优工艺参数[15-17]。儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、PGG作为白芍中含量较高的几种有效成分，对于临床疗效的发挥起着重要作用。因此，本实验以4种成分含量的总评归一值（overall desirability value，OD）为评价指标，采用单因素实验结合Box-Behnken响应面效应法优选白芍一体化最佳工艺参数，为白芍的一体化生产提供参考和依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；KQ-500B型超声清洗机，昆山市超声仪器有限公司；FA1104N型万分之一分析天平，上海菁海仪器有限公司；MS-105DU型十万分之一分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；TGL-16GB型高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；DHG-9140A型电热鼓风干燥器，上海精宏实验设备有限公司。

1.2 药材与试剂

实验所需白芍样品均采自安徽省亳州市，经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定，均为毛茛科植物芍药Pall.的干燥根。对照品芍药苷（批号110736-202044，质量分数≥98%）、儿茶素（批号110877-202005，质量分数95.18%）购自中国食品药品检定研究院；芍药内酯苷（批号DST201212-07，质量分数≥98%）、PGG（批号DST200518-001，质量分数≥98%），购自成都乐美天医药科技有限公司。甲醇，色谱纯，批号202105），江苏汉邦科技有限公司，磷酸，色谱纯，批号G2014050，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

2 方法与结果

2.1 白芍的加工炮制

2.1.1 白芍传统加工炮制 取新鲜白芍，洗净，除去头尾和细根，置于沸水中煮，用瓷质刮刀除去外皮，干燥；取白芍药材，净制，润透，切薄片，干燥。

2.1.2 白芍产地加工与炮制生产一体化 取新鲜白芍，洗净，除去头尾和细根，置于沸水中煮，用瓷质刮刀除去外皮，干燥至一定程度，趁鲜切薄片，干燥。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别称取儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、PGG对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，配制成含儿茶素13.71 µg/mL、芍药内酯苷93.86 µg/mL、芍药苷559.98 µg/mL、PGG 93.60 µg/mL的混合对照品溶液，混匀备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末约0.1 g（过4号筛），精密称定，置于25 mL量瓶中，加入50%乙醇溶解，定容至刻度，密塞，称定质量，超声处理30 min（40 kHz、1300 W），取出，放冷，补足减失的质量，摇匀，滤过，12 000 r/min离心（离心半径8 cm）10 min，上清液经0.22 µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 指标成分含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为依利特C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈- 0.05%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～8 min，5%～20%乙腈；8～14 min，20%～24%乙腈；14～17 min，24%～27%乙腈；17～23 min，27%～29%乙腈；23～25 min，29%～73%乙腈；25～27 min，73%～74%乙腈；27～29 min，74%～95%乙腈；体积流量1 mL/min；检测波长230 nm；柱温30 ℃；进样量10 µL。空白样品、混合对照品溶液及供试品溶液的色谱图见图1。在此条件下，理论塔板数（）按儿茶素峰、PGG峰计算均不低于20 000，按芍药内酯苷峰、芍药苷峰计算均不低于30 000。所测4种成分的色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，表明分离度良好；4种成分的信噪比均大于10，符合定量测定要求；4种成分的拖尾因子均在0.95～1.05，表明色谱峰具有良好的对称性。

1-儿茶素 2-芍药内酯苷 3-芍药苷 4-PGG

2.3.2 专属性考察 根据图1可知，在本实验的色谱条件下，4种成分的分离度良好，且空白样品无干扰，表明试验专属性良好。

2.3.3 线性关系考察 取“2.2.2”项下制备的混合对照品溶液，分别梯度稀释为5个不同的质量浓度，按“2.2.1”项下色谱条件分别进样测定。以色谱峰面积为纵坐标（），样品质量浓度为横坐标（），绘制标准曲线，计算回归方程，结果分别为儿茶素＝15.094＋1.869，2＝0.999 7，线性范围0.86～13.71 µg/mL；芍药内酯苷＝6.105 8＋7.576 6，2＝0.999 5，线性范围5.87～93.86 µg/mL；芍药苷＝8.130 3＋47.022，2＝0.999 5，线性范围35.00～559.98 µg/mL；PGG＝12.66－5.425，2＝0.999 8，线性范围5.85～93.60 µg/mL；可见，各成分在相应质量浓度间线性范围良好。

2.3.4 精密度考察 按“2.2.1”项下色谱条件，精密吸取混合对照品溶液10 µL，连续进样测定6次，记录各成分的峰面积，计算儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、PGG峰面积的RSD值。结果显示，4种成分的RSD值分别为1.18%、1.62%、0.26%、0.29%，表明仪器精密度良好。

2.3.5 稳定性考察 取同一份供试品溶液（单因素实验中煮制时间为20 min时制备的一体化饮片样品），按“2.2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进样检测，记录各成分的峰面积，计算儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、PGG峰面积的RSD值。结果显示，4种成分的RSD值分别为1.35%、1.35%、0.23%、1.04%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.6 重复性考察 取白芍粉末（单因素实验中煮制时间为20 min时制备的一体化饮片样品）6份，精密称定，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样检测，记录各成分的峰面积，计算儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、PGG质量分数的RSD值。结果显示，4种成分的RSD值分别为1.69%、2.06%、1.47%、1.14%，表明该方法重复性良好。

2.3.7 加样回收率试验 取已测定4种成分含量的样品（单因素实验中煮制时间为20 min时制备的一体化饮片样品）6份，每份0.05 g，分别加入一定量的儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、PGG对照品溶液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样检测，记录各成分的峰面积。结果显示，儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、PGG的平均回收率分别为105.21%、98.00%、100.10%、106.04%，RSD值分别为0.83%、2.32%、1.14%、1.30%，表明该方法回收率良好。

2.4 单因素实验筛选白芍加工炮制一体化工艺参数

2.4.1 煮制时间 经预实验考察，白芍煮制10 min左右时可煮至透心，因此，本实验选择煮制时间为5、10、15、20、25 min的5个水平进行考察。取新鲜白芍适量，洗净，除去头尾和细根，置沸水中分别煮制5、10、15、20、25 min，用瓷质刮刀除去外皮，在60 ℃条件下烘干5 h（约4成干），于室温下放置2 h，趁鲜切2 mm薄片，60 ℃干燥2 h。考察不同煮制时间对儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、PGG的OD的影响，利用Hassan法对各效应值进行归一化[18]，本实验的效应值为有效成分的含量，效应值越大越好，因此，归一值i＝(i－min)/(max－min)，再对归一值求几何平均值，OD＝(12…d)1/n，OD分别为0.165、0.644、0.227、0.752、0.056。煮制时间为5 min时，白芍药材尚未煮至透心，而煮制时间为25 min时会出现裂片、卷片的现象，且两者的OD均较低，因此将煮制时间的最低、最高水平确定为10、20 min。

2.4.2 鲜药材干燥时间 取新鲜白芍适量，洗净，除去头尾和细根，置沸水中煮制15 min，用瓷质刮刀除去外皮，在60 ℃条件下分别烘干2、3、4、5、6、7 h，于室温下放置2 h，趁鲜切2 mm薄片，60 ℃干燥2 h。考察不同的鲜药材干燥时间对儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、PGG的OD的影响，OD分别为0.322、0.265、0.321、0.657、0.646、0.112。结果表明，OD随着干燥时间的增加呈现先增大后减小的趋势，因此，将后续实验鲜药材干燥时间的最低、最高水平确定为4、6 h。

2.4.3 鲜药材干燥温度 取新鲜白芍适量，洗净，除去头尾和细根，置沸水中煮制15 min，用瓷质刮刀除去外皮，分别在30、40、50、60、70、80 ℃条件下干燥5 h，于室温下放置2 h，趁鲜切2 mm薄片，60 ℃干燥2 h。考察不同的鲜药材干燥温度对儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、PGG的OD的影响，OD分别为0.518、0.247、0.522、0.141、0.384、0.638。当干燥温度为30 ℃时，实际生产中能耗较高；当干燥温度为70、80 ℃时，部分饮片出现炸心以及裂片的现象，且干燥程度较高难以切片。因此，将鲜药材干燥温度的最低、最高水平确定为40、60 ℃。

2.5 响应面优化白芍加工炮制一体化工艺

2.5.1 试验设计及结果 根据白芍一体化工艺参数的单因素考察结果及响应面法设计原理，选取3个考察因素为自变量，即煮制时间（1）、鲜药材干燥时间（2）、鲜药材干燥温度（3），每个因素均设计3个水平，并以儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、PGG的OD为响应值，进行3因素3水平的星点设计试验，从而确定白芍饮片的一体化最佳工艺条件。采用Design Expert 12.0软件中的星点设计方案安排17组白芍一体化加工的工艺条件，进行响应面回归分析，因素水平设计见表1、试验安排结果见表1。

2.5.2 方差分析及数据处理 以白芍中所含成分的OD为为因变量，采用Design Expert 12.0软件对1、2、3进行响应面回归分析，以OD对3个因素进行2元多项回归，得到拟合方程OD＝0.746 4＋0.032 81－0.052 52－0.013 53＋0.213 312－0.025 213－0.129 323－0.218 612－0.126 122－0.107 132。

拟合模型的方差分析及回归系数显著性检验结果见表2，拟合得到2项式模型的＜0.05，存在显著性，说明在研究范围内该模型具有统计学意义。因素12、12对响应值的影响差异具有统计学意义（＜0.05），因此，3种因素对响应值的影响并非是简单的线性关系，所选试验因素之间存在着显著的交互作用。回归方程失拟项＝0.299＞0.05，并无显著性差异，表明模型拟合度良好、试验误差小。因此，可以采用此模型优选白芍一体化工艺。使用Design Expert 12.0软件进行拟合，以三维效应面曲线图直观表现出煮制时间、鲜药材干燥温度、鲜药材干燥时间的两两交互作用对白芍一体化工艺的影响，结果见图2。煮制时间与鲜药材干燥时间的交互作用响应面图坡度较陡，说明煮制时间与鲜药材干燥时间的交互作用较强，对所考察成分的含量影响显著；煮制时间与鲜药材干燥温度、鲜药材的干燥时间与干燥温度的交互作用响应面图坡度较缓，说明这2个交互作用较弱，对所考察成分的含量影响较小。

表1 星点设计试验与考察结果

Table 1 Results of star point design test and investigation

试验号X1/minX2/hX3/℃儿茶素/%芍药内酯苷/%芍药苷/%PGG/%OD 120 (+1)5 (0)40 (−1)0.060.813.050.810.396 215 (0)6 (+1)60 (+1)0.040.893.500.860.315 315550 (0)0.101.233.330.860.755 4205600.060.772.850.790.342 5204 (−1)500.060.942.710.820.367 610 (−1)6500.060.492.470.500.010 7155500.071.053.140.910.563 8155500.111.213.330.910.781 9105600.071.053.000.810.496 10105400.070.693.680.740.449 11104500.081.103.070.840.559 12155500.111.253.400.930.835 13154600.071.033.481.060.661 14155500.111.213.360.920.798 15156400.071.153.240.980.624 16206500.071.063.411.140.671 17154400.081.012.750.830.453

表2 回归模型方差分析结果

Table 2 Analysis of variance results of regression model

误差来源平方和自由度均方F值P值误差来源平方和自由度均方F值P值 模型0.63290.0704.7100.027X120.20110.20113.5100.008 X10.00910.0090.5760.473X220.06710.0674.4900.078 X20.02210.0221.4800.263X320.04810.0483.2400.115 X30.00210.0020.0980.764残差0.10470.015 X1X20.18210.18212.2100.010失拟项0.05930.0121.7300.299 X1X30.00310.0030.1710.691误差0.04540.011 X2X30.06710.0674.4900.072总离差0.73616

图2 煮制时间、鲜药材干燥时间和鲜药材干燥温度的交互作用响应面

根据Design Expert 12.0软件分析计算，白芍一体化加工的最佳工艺条件为煮制时间14.114 min，鲜药材干燥时间为4.512 h，鲜药材干燥温度为52.529 ℃，理论计算得分为0.755。

2.5.3 验证试验 为方便实验操作，根据“2.5.2”项优选出的白芍一体化最佳工艺参数，进行相应调整，将最佳工艺参数修正为煮制时间14 min，鲜药材干燥时间为4.5 h，鲜药材干燥温度为52.5 ℃。平行制备3批样品，测定各指标成分的含量，得出OD为0.767，与预测值0.755的相对误差为1.59%，表明本实验所建数学模型准确可靠，预测能力较强，一体化最佳工艺条件重现性好。

2.5.4 与传统工艺比较 以所选4种指标性成分为评价指标，进一步评价本实验优化所得一体化工艺与白芍传统加工炮制工艺对相关成分的影响，结果见表3。可见与传统工艺相比，一体化工艺能够明显减少芍药内酯苷和芍药苷在润制过程中的流失。

3 讨论

中药材产地加工与炮制生产一体化是将中药材产地加工环节和饮片炮制生产过程有机结合，以减少生产重复环节，提高饮片质量，由此加强中药饮片生产过程质量控制并建立的一体化生产关键技术体系[19]。虽然一体化具有摒弃重复生产工序、降低生产成本、提高产地加工机械化程度、规范饮片管理等诸多优势，但目前仍处于起步阶段，缺少基础研究、品种遴选原则、生产技术规范、质量控制标准等[20]。

表3 一体化工艺与传统工艺比较结果

Table 3 Comparison between integrated process and traditional process

加工方式儿茶素/%芍药内酯苷/%芍药苷/%PGG/% 一体化工艺10.051.142.840.77 一体化工艺20.051.162.800.74 一体化工艺30.051.152.770.74 一体化工艺均值0.051.152.810.75 传统加工0.040.932.750.84

2021年7月，国家药监局综合司发布关于中药饮片生产企业采购产地加工（趁鲜切制）中药材有关问题的复函，复函中明确指出：中药饮片生产企业可以采购具备健全质量管理体系的产地加工企业生产的产地趁鲜切制中药材用于中药饮片生产。随后，各省市相继出台与趁鲜切制相关的一系列政策，引导与规范趁鲜加工的发展，这极大地促进了一体化的进程，成为一体化发展的里程碑事件。因此，在政策的支持与鼓励下，应积极开展一体化基础研究，遴选适宜一体化加工的品种，建立相关技术规范，让中医药走上高质量发展之路。本实验在单因素实验的基础上，采用Box-Behnken响应面法对白芍一体化加工过程中的煮制时间、鲜药材干燥时间和鲜药材干燥温度3个关键因素进行考察，经过建立拟合方程和方差分析，最终确定一体化最佳工艺参数。并通过与传统加工炮制的白芍进行比较，验证所选工艺的合理性。因此，采用Box-Behnken响应面法优选白芍的一体化工艺可操作性好、重复性好，具有较强的实际意义，为白芍饮片的一体化加工生产和技术规范的形成提供了科学的依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Study on integrated process of producing area and processing production forbased on Box-Behnken response surface methodology

ZHANG Jiu-ba1, ZHANG Wei1, 2, WANG Bin1, JIN Shi-jie1, PENG Rui-tan3, MAO Chun-qin1, WANG Xia- chang1, CAO Hui4, LU Tu-lin1

1. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. College of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012, China 3. Baohetang (Bozhou) Pharmaceutical Co., Ltd., Bozhou 236800, China 4. College of Pharmacy, Jinan University, Guangzhou 510632, China

In order to solve the problems of component loss and repeated production in the traditional processing process of(PRA), the integrated technology of primary processing for PRA was optimized by response surface methodology.The Box-Behnken response surface design methodology was used to investigate the three factors of boiling time, fresh medicinal material drying time and temperature in the integrated process. The integrated process optimization was studied by using the overall desirability value (OD value) of catechin, albiflorin, paeoniflorin, and 1,2,3,4,6--pentagalloyl glucose in PRA as evaluation indexes.The results showed that the best integrated technological conditions were as follows: boiling time 14.11 min, drying time 4.51 h and drying temperature 52.53℃.The study showed that the response surface methodology is simple and easy to optimize the integrated primary processing for PRA and has good accuracy, which provides a scientific reference for the integrated processing and production of PRA.

; Box-Behnken response surface methodology; integrated technology of primary processing; overall desirability value; catechin; albiflorin; paeoniflorin; 1,2,3,4,6--pentagalloyl glucose

R283.6

A

0253 - 2670(2022)18 - 5657 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.008

2022-03-28

国家重点研发计划“中医药现代化研究”专项（2019YFC1711500）

张玖捌（1998—），男，硕士研究生，研究方向为中药炮制及中药饮片质量标准研究。Tel: 15895865293 E-mail: 20200598@njucm.edu.cn

陆兔林，男，教授，博士生导师，主要从事中药炮制及中药饮片质量标准研究。Tel: 13951636763 E-mail: ltl2021@ njucm.edu.cn

[责任编辑 郑礼胜]