基于HPLC指纹图谱与化学模式相结合的益气活血通便方提取工艺优选

李 硕，杨晓玲，权起元，刘书斌，王本欢，杨秀娟，赵林华，李越峰*，仝小林*

基于HPLC指纹图谱与化学模式相结合的益气活血通便方提取工艺优选

李 硕1, 2，杨晓玲1，权起元1，刘书斌3，王本欢1，杨秀娟1，赵林华4，李越峰1*，仝小林4*

1. 甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000 2. 甘肃省高校中（藏）药化学与质量研究省级重点实验室，甘肃 兰州 730000 3. 甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050 4. 中国中医科学院广安门医院，北京 100053

建立基于HPLC指纹图谱与化学模式相结合的益气活血通便方（Yiqi Huoxue Tongbian Recipe，YHTR）提取工艺优选方法。采用HPLC法建立YHTR指纹图谱，并同时测定绿原酸、松果菊苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素7种指标性成分含量，以干膏率及7种成分含量为指标，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）和模糊物元模型（fuzzy matter-element model，FMEM）2种化学模式识别技术优选YHTR最佳提取工艺。不同提取工艺的YHTR HPLC指纹图谱标定20个共有峰，相似度在0.782～0.999；7个指标性成分质量分数分别为7.3～57.3、727.6～10 584.7、13.4～79.2、31.7～105.0、100.1～1 115.3、7.4～41.9、2.3～19.0 μg/g，干膏率为17.8%～24.3%。FMEM和PCA结果一致，YHTR的指标性成分含量与提取时间、提取次数以及加水倍数具有相关性。从7种指标性成分提取率和干膏得率角度考虑，YHTR最佳提取工艺为加10倍量水，提取3次，每次提取时间60 min。通过指纹图谱结合化学模式识别技术的分析策略可快速有效的筛选YHTR最佳提取工艺，为YHTR后续制剂开发提供了参考。

益气活血通便方；指纹图谱；主成分分析；模糊物元模型；质量评价；绿原酸；松果菊苷；毛蕊异黄酮葡萄糖苷；阿魏酸；毛蕊花糖苷；毛蕊异黄酮；芒柄花素

便秘是临床上常见的胃肠道功能紊乱性疾病，我国成人慢传输型便秘（slow transit constipation，STC）占整个便秘患者的15%～42%[1-5]。仝小林院士基于“态靶同调”辩证理念[6-9]，认为STC的主要病因病机是气血津液亏虚、肠燥失运，结合临床实践总结出由黄芪、当归、肉苁蓉、火麻仁组成的益气活血通便方（Yiqi Huoxue Tongbian Recipe，YHTR），针对年老体弱、产后、久病引起的气血亏虚、肠道濡润失司的慢性功能性便秘人群，有明显的补气养血、润肠通便作用，临床治疗效果显著。

目前，YHTR的药效物质基础、制剂工艺及质量评价方面鲜有研究报道，因此确定YHTR的最佳提取工艺、反映组方整体质量的指纹图谱及多指标成分含量的质量评价方法显得尤为重要[10-15]。本实验以YHTR为研究对象，通过HPLC指纹图谱对其主要化学成分进行宏观整体表征，并对不同提取工艺的干膏率及7种指标性成分绿原酸、松果菊苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素进行含量测定，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和模糊物元模型（fuzzy matter-element model，FMEM）确定YHTR最佳提取工艺，并进行基于多指标成分的质量综合评价，为YHTR质量控制及后续制剂开发提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1260高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；800型离心沉淀器，上海手术器械十厂；MH-500型可调式电热套，北京科伟永兴仪器有限公司；HHS-11S型电子恒温不锈钢水浴锅，上海宜昌仪器纱筛厂；KQ-250TDB型高频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；DHG-9123A型电子恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司。

1.2 药材

黄芪（批号20220402）、当归（批号20220203）、肉苁蓉（批号21080601）、火麻仁（批号22032802）饮片由甘肃中医药大学附属医院提供，经甘肃中医药大学药学院李成义教授鉴定来源于豆科黄芪属植物蒙古黄芪(Fisch.) Bge. var(Bge.) Hsiao的干燥根，伞形科当归属植物当归(Oliv.) Diels的干燥根，列当科肉苁蓉属植物肉苁蓉Y. C. Ma的干燥带鳞叶的肉质茎，桑科大麻属植物大麻L.的干燥成熟果实。

1.3 试剂

色谱纯甲醇（批号20220504）、甲酸（批号20210301）、乙腈（批号20220401）购自天津市大茂化学试剂厂；对照品绿原酸（批号MUST- 21030920）、松果菊苷（批号MUST-21101117）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号MUST-21033005）、阿魏酸（批号MUST-22011214）、毛蕊花糖苷（批号MUST-210070910）、毛蕊异黄酮（批号MUST- 21042513）、芒柄花素（批号MUST-21122712）购自成都曼斯特生物技术有限公司，以上对照品质量分数均≥98%。

2 方法与结果

2.1 样品制备

依据处方配伍，分别精密称取黄芪15 g、当归15 g、肉苁蓉18 g、火麻仁30 g，加适量蒸馏水浸泡后，热回流装置密闭提取，将提取液趁热用纱布滤过，即得煎煮液；将煎煮液浓缩并定容至100 mL即得浓缩液；取浓缩液10 mL于已恒定质量的蒸发皿中水浴蒸干，置于烘箱中烘至干燥，取出后，置于干燥器中干燥30 min，称定质量，即得干浸膏。

根据传统中药汤剂煎煮法及预实验结果，选取对煎煮效果影响较大的关键因素“加水倍数、提取时间、提取次数”作为提取工艺影响因子，结合单因素考察实验，设计3因素3水平的响应面分析试验，对YHTR不同提取工艺进行筛选，响应面分析因素水平见表1。

表1 YHTR的响应面分析试验因素水平

Table 1 Response surface analysis factor level of YHTR

试验号加水倍数/倍提取时间/min提取次数 S18402 S212402 S38602 S412602 S58501 S612501 S78503 S812503 S910401 S1010601 S1110403 S1210603 S1310502 S1410502 S1510502 S1610502 S1710502

2.2 色谱条件

色谱柱为Agilent Zorbax SB-Aq柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～5 min，10%～13%乙腈；5～13 min，13%～17%乙腈；13～20 min，17%～21%乙腈；20～26 min，21%～25%乙腈；26～30 min，25%～38%乙腈；30～34 min，38%～43%乙腈；34～40 min，43%～90%乙腈；40～50 min，90%～10%乙腈；50～60 min，10%乙腈；体积流量1.0 mL/min；检测波长280 nm；进样量10 μL；柱温30 ℃。

2.3 供试品溶液的制备

精密移取“2.1”项下浓缩液1 mL，置于蒸发皿中，水浴蒸干后加入70%甲醇溶解，定容于至10 mL量瓶中，静置，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 对照品溶液的制备

分别精密称定绿原酸、松果菊苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素7种对照品适量，加入70%甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，制成质量浓度分别为0.01、0.01、0.05、0.06、0.14、0.20、0.20 mg/mL的混合对照品溶液储备液，备用。

2.5 指纹图谱研究

2.5.1 精密度试验 精密吸取按照“2.1”和“2.3”项下方法制得的同一供试品溶液（S15），按照“2.2”项下色谱条件连续重复进样6次，每次进样10 μL，记录HPLC色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价（2012版）》软件进行评价分析，结果表明，6个供试品溶液的色谱图相似度为0.996～1.000，20个共有峰相对保留时间的RSD为0.08%～0.77%，相对峰面积的RSD为0.28%～2.98%，表明该方法精密度较好。

2.5.2 重复性试验 精密吸取按照“2.1”和“2.3”项下方法制得的6份供试品溶液（S15），按照“2.2”项下色谱条件进样分析，每次进样10 μL，记录HPLC色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价（2012版）》软件进行评价分析，结果表明，6个供试品溶液色谱图的相似度分别为0.993～1.000，20个共有峰相对保留时间的RSD为0.08%～1.22%，相对峰面积的RSD为0.33%～2.70%，结果表明该方法重复性良好。

2.5.3 稳定性试验 精密吸取按照“2.1”和“2.3”项下方法制得的同一供试品溶液（S15），分别在制备后0、2、4、8、12、24 h按照“2.2”项下色谱条件进样分析，每次进样10 μL，记录HPLC色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价（2012版）》软件进行评价分析，结果表明，6个供试品色谱图与其共有模式的相似度分别为0.994～1.000，20个共有峰相对保留时间的RSD为0.22%～3.17%，相对峰面积的RSD为0.51%～2.94%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.4 HPLC指纹图谱的建立及相似度分析 取“2.1”项下17份试验样品，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。将17份样品的HPLC图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价（2012版）》软件，以S1号样品的色谱图为参照图谱，时间窗的宽度为0.5 min、中位数法生成对照指纹图谱（R），经多点校正后进行色谱峰匹配，生成17份样品的HPLC指纹图谱叠加图（图1）。

指纹图谱可获得样品的整体信息，通过图谱比较，可反映样品与样品之间的亲疏程度。以对照指纹图谱为参照，进行相似度评价分析，结果见表2。17份不同提取工艺YHTR样品的指纹图谱相似度为0.782～0.999，表明各提取工艺下样品的指纹图谱相对稳定。

图1 17份不同提取工艺YHTR样品的HPLC指纹图谱叠加图及其对照指纹图谱(R)

表2 17份YHTR样品指纹图谱相似度评价结果

Table 2 Similarity evaluation of fingerprints of 17 batches of YHTR

样品相似度S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15S16S17R S11.000 0.972 0.888 0.922 0.827 0.977 0.878 0.818 0.934 0.968 0.957 0.817 0.686 0.939 0.937 0.928 0.923 0.934 S20.972 1.000 0.958 0.978 0.800 0.968 0.963 0.893 0.854 0.956 0.958 0.923 0.801 0.988 0.987 0.982 0.980 0.988 S30.888 0.958 1.000 0.965 0.652 0.942 0.980 0.836 0.789 0.936 0.953 0.978 0.792 0.977 0.977 0.976 0.976 0.979 S40.922 0.978 0.965 1.000 0.806 0.930 0.989 0.934 0.778 0.912 0.927 0.958 0.829 0.996 0.996 0.997 0.997 0.996 S50.827 0.800 0.652 0.806 1.000 0.741 0.729 0.889 0.696 0.715 0.702 0.621 0.620 0.782 0.780 0.775 0.773 0.782 S60.977 0.968 0.942 0.930 0.741 1.000 0.904 0.781 0.946 0.998 0.996 0.866 0.669 0.952 0.951 0.943 0.939 0.949 S70.878 0.963 0.980 0.989 0.729 0.904 1.000 0.920 0.719 0.887 0.907 0.988 0.855 0.987 0.987 0.989 0.990 0.990 S80.818 0.893 0.836 0.934 0.889 0.781 0.920 1.000 0.600 0.751 0.763 0.867 0.850 0.907 0.908 0.908 0.910 0.915 S90.934 0.854 0.789 0.778 0.696 0.946 0.719 0.600 1.000 0.954 0.935 0.659 0.444 0.811 0.808 0.794 0.787 0.803 S100.968 0.956 0.936 0.912 0.715 0.998 0.887 0.751 0.954 1.000 0.996 0.851 0.642 0.937 0.936 0.927 0.923 0.934 S110.957 0.958 0.953 0.927 0.702 0.996 0.907 0.763 0.935 0.996 1.000 0.879 0.655 0.950 0.949 0.941 0.938 0.946 S120.817 0.923 0.978 0.958 0.621 0.866 0.988 0.867 0.659 0.851 0.879 1.000 0.849 0.959 0.960 0.963 0.966 0.963 S130.686 0.801 0.792 0.829 0.620 0.669 0.855 0.850 0.444 0.642 0.655 0.849 1.000 0.816 0.817 0.820 0.823 0.831 S140.939 0.988 0.977 0.996 0.782 0.952 0.987 0.907 0.811 0.937 0.950 0.959 0.816 1.000 1.000 0.999 0.999 0.999 S150.937 0.987 0.977 0.996 0.780 0.951 0.987 0.908 0.808 0.936 0.949 0.960 0.817 1.000 1.000 0.999 0.999 0.999 S160.928 0.982 0.976 0.997 0.775 0.943 0.989 0.908 0.794 0.927 0.941 0.963 0.820 0.999 0.999 1.000 1.000 0.997 S170.923 0.980 0.976 0.997 0.773 0.939 0.990 0.910 0.787 0.923 0.938 0.966 0.823 0.999 0.999 1.000 1.000 0.997

2.5.5 共有峰指认及归属研究 精密移取“2.4”项下混合对照品储备液1ml，用70%甲醇定容到10ml容量瓶中，按“2.2”项下色谱条件进行检测，记录各对照品色谱图。以色谱峰相对保留时间为参照，对17份样品进行色谱峰的指认。确定20个共有特征峰。通过与对照品溶液色谱图对比，确定其中7号为绿原酸，10号为松果菊苷，13号为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，14号为阿魏酸，15号为毛蕊花糖苷，19号为毛蕊异黄酮，20号为芒柄花素。具体见图2-A、2-B。

7-绿原酸 10-松果菊苷 13-毛蕊异黄酮葡萄糖苷 14-阿魏酸 15-毛蕊花糖苷 19-毛蕊异黄酮 20-芒柄花素

2.6 7个指标成分含量测定

2.6.1 线性关系考察 分别精密吸取“2.4”项下毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、阿魏酸、绿原酸、毛蕊花糖苷对照品储备液1.2、0.5、1.2、0.8、5.0 mL，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容，稀释1、5、10、12.5、20倍得系列质量浓度梯度的混合对照品溶液。另分别取松果菊苷、芒柄花素对照品储备液，分别稀释1、10、20、40、80倍和1、5、7、8、10倍，即得各系列质量浓度梯度的对照品溶液。精密吸取各对照品溶液与混合对照品溶液10 μL，按“2.2”项下色谱条件分别进样测定，以各成分的质量浓度为横坐标（），相应的峰面积为纵坐标（），进行线性回归，得到各成分的回归方程，结果分别为绿原酸＝14.117－0.060 3，2＝0.999 9，线性范围0.4～8.0 μg/mL；松果菊苷＝7.246 8－49.184 0，2＝1.000 0，线性范围12.5～1 000.0 μg/mL；毛蕊异黄酮葡萄糖苷＝17.056－1.776 5，2＝0.999 7，线性范围0.6～12.0 μg/mL；阿魏酸＝27.841－2.989 5，2＝0.999 7，线性范围0.6～12.0 μg/mL；毛蕊花糖苷＝8.729 9－6.754 1，2＝1.000 0，线性范围5～100 μg/mL；毛蕊异黄酮＝25.909－0.469 7，2＝0.999 9，线性范围0.25～5.00 μg/mL；芒柄花素＝19.585－0.529 8，2＝0.999 8，线性范围0.3～3.0 μg/mL。

2.6.2 精密度试验 精密吸取“2.4”项下对照品溶液，按照“2.2”项下色谱条件连续重复进样6次，每次进样10 μL，测定峰面积，记录HPLC图。测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、阿魏酸、绿原酸、松果菊苷、毛蕊花糖苷峰面积的RSD分别为1.68%、0.67%、1.34%、0.76%、0.98%、0.28%、0.98%，表明仪器精密度良好。

2.6.3 重复性试验 精密吸取按照“2.3”项下方法制得的6份供试品溶液（S15），按照“2.2”项下色谱条件进样，每次进样10 μL，记录HPLC色谱图。测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、阿魏酸、绿原酸、松果菊苷、毛蕊花糖苷峰面积，并计算其含量与RSD值。结果显示，样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、阿魏酸、绿原酸、松果菊苷、毛蕊花糖苷质量分数的RSD分别为1.61%、0.51%、1.41%、1.93%、1.67%、0.54%、0.86%，表明该方法重复性良好。

2.6.4 稳定性试验 精密吸取按照“2.3”项下方法制得的同一供试品溶液（S15），分别在制备后0、2、4、8、12、24 h按照“2.2”项下色谱条件进样分析，每次进样10 μL，记录HPLC色谱图。测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、阿魏酸、绿原酸、松果菊苷、毛蕊花糖苷峰面积的RSD分别为0.94%、0.35%、1.67%、1.68%、1.47%、0.33%、0.87%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6.5 加样回收率试验 精密移取已测定7种指标成分的样品（S15）浓缩液0.5 mL，共6份，分别加入与样品中含量相同的绿原酸、松果菊苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素的对照品，按照“2.3”项方法制备供试品溶液，依据“2.2”项色谱条件测定，记录峰面积，并计算7种成分的加样回收率，结果绿原酸、松果菊苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素的平均加样回收率分别为97.87%、98.18%、99.77%、100.34%、100.38%、99.39%、98.70%，RSD分别为3.06%、1.05%、3.49%、1.51%、1.33%、2.13%、3.37%。

2.6.6 含量测定 按“2.3”项下方法制备17份供试品溶液（平行3份），按“2.2”项下色谱条件对7种指标性成分含量进行测定；按“2.1”项下方法制备干浸膏，计算干膏率（干浸膏/复方原药材质量），结果见表3。

2.7 基于2种数学模型筛选最佳提供工艺

2.7.1 基于PCA的评价 PCA采用统计学降维分析原理，将多个变量简化为几个综合变量，使新变量成为原变量的线性组合，是一种适用于多指标大样本的综合分析方法。通过SPSS 21.0软件对绿原酸、松果菊苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素7种指标性成分及干膏率进行PCA，结果见表4。由表4可知，前2个主成分为毛蕊花糖苷和毛蕊异黄酮，其特征值均＞1，说明前2个主成分在影响YHTR水煎液质量评价指标中起主导作用，2个主成分累积贡献率达89.66%，能够较客观地反映YHTR水煎液内在质量，故选取前2个主成分进行分析。

表3 17份样品中7种指标性成分含量及干膏率

Table 3 Contents of seven index components and dry paste rate of 17 batches of test solution

样品质量分数/(μg∙g−1)干膏率/% 绿原酸松果菊苷毛蕊异黄酮葡萄糖苷阿魏酸毛蕊花糖苷毛蕊异黄酮芒柄花素 S114.81 145.837.651.5155.328.211.819.40 S214.51 810.344.150.9141.926.812.620.30 S332.76 316.845.653.0540.519.15.722.80 S442.55 602.665.647.4554.536.411.122.30 S511.01 331.927.932.4209.514.75.219.90 S627.72 443.028.145.8303.317.45.820.90 S739.47 042.764.164.0633.831.98.723.10 S829.46 667.579.267.0492.941.919.022.90 S97.3727.613.431.7100.17.42.317.80 S109.01 777.424.441.8169.311.93.720.20 S1132.73 991.560.658.2352.138.413.021.50 S1257.310 584.760.868.91 115.329.812.624.30 S1334.84 789.466.4105.0487.536.511.022.10 S1440.84 695.164.379.7511.636.611.521.90 S1541.84 727.865.778.6514.236.711.221.90 S1637.44 670.851.158.2533.031.513.921.80 S1739.74 769.953.859.8537.131.914.122.00

由表5可见，处方各因子载荷系数能综合反映各成分对第1、2主成分的影响。其中，毛蕊花糖苷的因子载荷量在第1主成分中最大，说明其对处方质量评价的影响最大。毛蕊异黄酮载荷系数为0.936，是影响第2主成分的主要因子，毛蕊花糖苷与毛蕊异黄酮成分呈正相关。

表4 主成分的特征值及贡献率

Table 4 Eigenvalue of principal components and cumulative contribution rates

主成分初始特征值旋转后特征值合计方差贡献率/%累积贡献率/%合计方差贡献率/%累积贡献率/% 15.95174.39074.3903.83147.89247.892 21.22215.27189.6613.34241.77089.661 30.4735.91395.574 40.1531.91097.484 50.1371.71099.194 60.0500.63099.824 70.0080.10599.928 80.0060.072100.000

表5 旋转后的因子载荷系数

Table 5 Principal component load matrix and coefficient

成分因子载荷系数 第1主成分第2主成分 绿原酸0.8580.419 松果菊苷0.9350.296 毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.5130.830 阿魏酸0.3830.705 毛蕊花糖苷0.9580.229 毛蕊异黄酮0.3040.936 芒柄花素0.1790.894 干膏率0.8770.407

根据各主要因子的权重系数进行累加，权重系数的计算依据其方差贡献率的大小，即各主成分的贡献率与2个主成分的总贡献率之比，第1主成分的权重1＝47.892%/89.661%＝0.534，则第2主成分权重2为0.466。根据公式＝0.5441＋0.4662，得出各个YHTR水煎液的总因子得分（）并排序，得分越高，表明该样品质量越好。具体排序见表6。

表6 2种数学模型评价结果

Table 6 Evaluation results of two mathematical models

排序PCAFMEM样品F样品贴近度值 1S127.379S120.639 2S74.925S80.434 3S84.631S130.425 4S34.396S70.423 5S43.998S150.399 6S133.491S140.395 7S173.476S40.376 8S153.457S170.349 9S143.435S160.336 10S163.408S30.320 11S112.894S110.316 12S61.873S60.191 13S21.404S20.190 14S101.364S10.176 15S51.117S50.131 16S10.999S100.131 17S90.653S90.081

2.7.2 基于变异系数的FMEM评价 FMEM以模糊数学为基础，将用于描述某一事物集合的3个要素“事物”“特征”“量值”，与中药“样品”“成分”“含量”一一对应，如给定样本名称，使它关于特征有量值，以有序3元组＝(,,)作为描述事物的基本元，简称为物元3要素，如果其中量值具有模糊性，则称为模糊物元。已有李喜香等[16]、刘书斌等[17]和杨蕊菁等[18]通过建立FMEM对大黄、党参等中药进行质量评价，取得了较为满意的结果。

本研究为不同提取工艺的YHTR，为所评价的指标性成分种类，为7种指标性成分含量及干膏率。基于变异系数计算有关评价指标的权重，步骤如下：

（2）计算第项评价指标的均值D，即：

（3）计算第项评价指标的变异系数δ，即：

δ＝D×

（4）计算第项评价指标的权重W，即：

W＝δ×δ

本研究结合欧氏贴近度概念，计算7种指标成分及干膏率评价指标的变异系数（δ）分别为0.076、0.164、0.127、0.135、0.159、0.053、0.013和0.007，权重（W）分别为0.103、0.224、0.172、0.184、0.216、0.072、0.018和0.010，建立基于变异系数权重的FMEM，得到贴近度复合模糊物元，对17批样品的质量进行排序和综合评价，见表6。

从表6看出，2种评价方法的排序结果基本一致，S12、S8、S7均靠前4名次，S9、S10、S1、S5均靠后4名次，说明采用2种数学模型对基于7种指标性成分以及干膏率对YHTR 17种不同提取工艺的评价令人满意。

依据2种方法评价发现，YHTR的指标性成分含量与提取时间、提取次数以及加水倍数具有相关性。从7种指标性成分提取率和干膏得率角度考虑，YHTR最佳提取工艺为加10倍量水，提取3次，每次提取时间60 min。

2.8 最佳提取工艺验证

采用最佳提取工艺提取样品，按“2.3”项下方法制备6批供试品溶液（Y1～Y6），按“2.2”项下色谱条件对7种指标性成分含量进行测定；按“2.1”项下方法制备干浸膏，计算干膏率，对优选的最佳提取工艺进行验证，结果见表7。测得绿原酸、松果菊苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素含量及干膏率的RSD分别为1.53%、1.31%、2.14%、2.08%、1.01%、1.37%、2.25%、0.56%，表明所优选的提取工艺方法可靠。

3 讨论

本实验首次建立了YHTR的指纹图谱，同时结合化学模式识别筛选出处方的最佳提取工艺，为质量评价提供理论依据。实验过程中，为了确保所建立的指纹图谱能全面优化提取工艺，考察了不同紫外吸收波长（254、270、280、290 nm）下色谱峰的数目和峰面积差异，发现280 nm下色谱峰信息较丰富，故选择280 nm作为检测波长。此外，本实验通过对色谱柱的考察，发现色谱柱Agilent Zorbax SB-Aq柱能较好地分离各个被测成分的峰，且色谱峰的峰型较好。结合上述实验条件，建立YHTR HPLC指纹图谱，并同时测定绿原酸、松果菊苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素7种指标性成分含量，以干膏率及7种成分含量为指标，利用PCA和FMEM 2种化学模式识别技术优选YHTR最佳提取工艺。本研究确定的HPLC指纹图谱条件重现性良好、稳定性可靠、分辨率清晰，结合化学识别模式建立的数学模型拟合信息丰富、预测能力优良、判别能力精准，可适用于YHTR提取工艺优选及质量评价。

表7 6份工艺验证样品中7种指标性成分含量及干膏率

Table 7 Contents of seven index components and dry paste rate of six batches of test solution

样品质量分数/(μg∙g−1)干膏率/% 绿原酸松果菊苷毛蕊异黄酮葡萄糖苷阿魏酸毛蕊花糖苷毛蕊异黄酮芒柄花素 Y158.110 485.961.967.21 117.029.113.224.56 Y258.610 622.362.068.21 116.029.612.424.22 Y358.210 644.664.568.31 112.828.912.624.25 Y456.310 329.161.366.51 113.229.912.824.23 Y557.310 584.760.868.91 115.329.812.624.30 Y656.910 721.361.265.11 087.629.712.524.20

指纹图谱能较全面地反映出中药中所含化学成分的种类和数量，进而反映药材整体质量和临床疗效[19-23]。实验数据表明，17批不同提取工艺的YHTR水煎液的指纹图谱，出峰时间大体一致，但相似度计算结果却有明显差异，说明不同提取工艺对YHTR的质量有显著影响。

本实验引入PCA，将不同提取工艺的YHTR水煎液主成分进行排序，又借助基于变异系数的FMEM对其进行排序，2种数学模式所得的结果极相近，说明毛蕊花糖苷和毛蕊异黄酮可作为组方水煎液质量评价的标志性成分，可为评价YHTR的质量提供更为全面的参考。

PCA和FMEM属于2种不同模式的数学模型，但对YHTR的不同提取工艺评价较为一致，说明YHTR的指标性成分与提取时间、提取次数以及加水倍数具有相关性。PCA法并未全面考虑这些因素，只是考虑了不同提取工艺各成分的贡献率和成分之间的相关性，而FMEM利用变异系数考虑了评价指标权重的均衡性，极大程度上降低人为赋权的主观偏好性因素的影响。因此，本实验采用2种数学模型结合的方式进行实验数据分析，从而降低了人为原因造成的分析误差，能更全面、准确地评价YHTR的提取工艺及其整体质量。

本实验采用指纹图谱和化学模式识别相结合的方法优化YHTR的提取工艺，并以7种指标性成分含量及干膏率对YHTR进行质量综合评价，为YHTR的质量控制及临床应用安全有效提供了可靠依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Extraction process optimization of Yiqi Huoxue Tongbian Recipe based on the combination of HPLC fingerprint and chemical model

LI Shuo1, 2, YANG Xiao-ling1, QUAN Qi-yuan1, LIU Shu-bin3, WANG Ben-huan1, YANG Xiu-juan1, ZHAOLin-hua4, LI Yue-feng1, TONG Xiao-lin4

1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China 2. Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese Medicines of the College of Gansu Province, Lanzhou 730000, China 3. Gansu Provincial Hospital of TCM, Lanzhou 730050, China 4. Guang’anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Science, Beijing 100053, China

Based on the combination of HPLC fingerprint and chemical model, the method for optimizing the extraction process of Yiqi Huoxue Tongbian Recipe (YHTR) was established.The fingerprint of YHTR was established by HPLC, and the contents of seven index components including chlorogenic acid, echinacoside, calycosin-7-glucoside, ferulic acid, acteoside, calycosin, formononetin were determined at the same time. Taking the dry paste rate and the content of seven components as indicators, two chemical pattern recognition techniques(PCA and FMEM) were used to optimize the optimal extraction process of YHTR.The HPLC fingerprints of YHTR with different extraction processes were used to calibrate 20 common peaks, and the similarity ranged from 0.782 to 0.999; The mass fractions of 7 index components were 7.3—57.3, 727.6—10 584.7, 13.4—79.2, 31.7—105.0, 100.1—1 115.3, 7.4—41.9, 2.3—19.0 mg/g respectively. The dry extract rate of different extraction processes was 17.8%—24.3%. The results of fuzzy matter-element model and principal component analysis are consistent, and the content of index components of YHTR is related to extraction time, extraction times and water addition times. From the perspective of the extraction rate of seven index components and the yield of dry paste, the best extraction process of YHTR is to add 10 times of water, extract three times, and extract for 60 min each time.The analysis strategy of fingerprint combined with chemical pattern recognition technology can quickly and effectively screen the best extraction process of YHTR. The established multi index quality evaluation method provides a reference for the quality control and subsequent preparation development of YHTR.

Yiqi Huoxue Tongbian Recipe; fingerprint; principal component analysis; fuzzy matter-element model;quality evaluation; chlorogenic acid; echinacoside; calycosin-7-glucoside; ferulic acid; acteoside; calycosin; formononetin

R283.6

A

0253 - 2670(2022)18 - 5692 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.012

2022-08-29

国家自然科学基金资助项目（81960713）；国家自然科学基金资助项目（82160750）；国家自然科学基金资助项目（82160755）；甘肃省高等学校创新基金项目（2021A-079）；甘肃省中医药科研课题项目（GZKZ-2021-7）；甘肃省自然科学基金项目（18JR3RA201）；甘肃省基础研究创新群体项目（21JR7RA569）；甘肃省青年科技基金项目（20JR10RA331）；甘肃省教育厅项目（2121CYZC-21）；甘肃省教育厅项目（2021B-157）；甘肃省高校中（藏）药化学与质量研究省级重点实验室项目（zzy-2018-06）；敦煌医学与转化教育部重点实验室2020年度开放课题（DHYX20-10）

李 硕（1981—），女，副教授，硕士生导师，研究方向为中药品质评价及产品开发研究。Tel: 13919824303 E-mail: 290608323@qq.com

仝小林（1956—），男，主任医师，博士生导师，中国科学院院士，研究方向为中医内科学。Tel: 13910662116 E-mail: tongxiaolin@vip.163.com

李越峰（1974—），女，教授，博士生导师，研究方向为中药炮制及制剂开发。Tel: 13619349364 E-mail: lyfyxk@126.com

[责任编辑 郑礼胜]