葡萄VvERF90的克隆及对乙烯合成基因的调控研究

石中亚 魏红丽 栗温新 邹东方 黄莹莹 叶 霞 李志谦 冯建灿

(河南农业大学园艺学院，河南 郑州 450002)

葡萄(VitisviniferaL.)是世界广泛种植的重要果树之一，其浆果美味多汁，深受消费者欢迎。我国种植的葡萄以鲜食品种为主，在采后贮藏过程中易发生果粒穗梗褐变现象，严重影响葡萄的外观品质和经济价值。葡萄是典型的非呼吸跃变型果实，在生长和发育过程中乙烯释放量低，但是在采后贮藏过程中其穗梗的乙烯释放量比果粒高10～100倍，且一些品种在成熟前有乙烯释放量明显增加的现象[1-2]。进一步研究发现，穗梗褐变与穗梗的呼吸速率和乙烯释放量有密切联系[3-4]。已有研究表明，采用乙烯受体抑制剂1-甲基环丙烯(1-methylcyclopropene，1-MCP)处理阳光玫瑰和无核白葡萄采后果穗，可以明显抑制穗梗褐变，而乙烯利处理无核白可以加速穗梗褐变[2]；果实转色前用乙烯利处理，可以诱导果实转色和提高乙烯释放量[5]。可知乙烯是影响葡萄果实发育和采后贮藏的重要因素[6-8]，了解葡萄穗梗乙烯合成与调控机制对葡萄贮藏保鲜具有重要意义。

乙烯合成起始于甲硫氨酸，经过SAM合成酶(SAM synthetase)、ACC合成酶(ACC synthase，ACS)和ACC氧化酶(ACC oxidase，ACO)催化形成乙烯[9-10]，其中ACS和ACO是催化乙烯合成的两个限速酶[11]。研究表明，在呼吸跃变型果实中，乙烯信号路径的乙烯响应因子(ethylene response factor，ERF)转录因子，可以通过调控ACS[12-13]和ACO[14]基因的表达从而参与植物的乙烯合成过程。例如，在香蕉(Musaacuminata)中，MaERF11可以抑制MaACS1和MaACO1的启动子活性，抑制乙烯合成[15]；在苹果(Malusdomestica)生长发育过程中，MdERF2可以通过结合MdACS1和MdACS3a启动子关键顺式元件脱水应答顺式元件(dehydration-responsive element，DRE)，抑制上述2个基因的转录，MdERF3则通过与MdACS1启动子结合，上调其表达[13]。对葡萄中乙烯合成途径基因进行研究，发现在Shiraz葡萄中，VvACS1和VvACO1在果实成熟之前表达量较高[16]；在无核白葡萄中，VvACS1和VvACO1基因在果实成熟后、在穗梗中大量表达，且与穗梗中乙烯释放量呈显著正相关，其基因表达量直接影响采前和采后不同时期穗梗的乙烯释放量，表明VvACS和VvACO1是调控葡萄穗梗中乙烯合成的关键基因，但其上游调控因子并不清晰[1]。葡萄中AP2/ERF超家族共有122个成员，VvERF90属于ERF IX亚家族，在葡萄果皮、果肉、花序、叶片和茎中都有表达[17]。河南农业大学葡萄生物学与种质创新团队前期对阳光玫瑰葡萄穗梗褐变现象进行了研究，发现VvERF90在穗梗褐变过程中表达较高，且与穗梗中的乙烯释放呈正相关[4]。但是在非呼吸跃变型果实中，ERFs反馈调节乙烯合成的研究尚鲜见报道，尤其是葡萄穗梗中，乙烯释放量较高的原因，以及ERF是否可以通过调控VvACSs和VvACOs基因的表达，进而影响果实和穗梗生长发育及衰老，仍有待深入研究。

根据文献报道，ERF转录因子在调控乙烯生物合成过程中发挥重要作用[4,13]，将VvERF90与拟南芥、苹果和香蕉中的ERF蛋白进行聚类分析，发现VvERF90与苹果中可以调控乙烯合成的MdERF3和MdERF2亲缘关系较近，且穗梗中差异表达的调控乙烯合成的关键基因VvACO1上有ERF转录因子可以结合的DRE顺式元件，由此推测VvERF90可能是调控葡萄穗梗中乙烯合成的关键基因。因此，本研究克隆在阳光玫瑰葡萄采后贮藏过程中，与穗梗乙烯释放呈相关的ERF家族转录因子VvERF90(GSVIVT00014265001)，并在拟南芥中进行异源表达，旨在研究VvERF90与VvACO1之间的互作关系，探索VvERF90的基因功能，在分子水平上为调控葡萄穗梗乙烯合成奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

试验于2018年在河南农业大学园艺学院实验室进行，试验所用葡萄穗梗材料为采自郑大葡萄农庄种植基地的阳光玫瑰。在果实成熟期采摘果穗，分离穗梗，液氮冷冻后在-80℃条件下保存，用于RNA的提取。本氏烟草(Nicotianabenthamiana)和拟南芥(Arabidopsisthaliana，哥伦比亚型拟南芥)均种植在人工气候室中，培养条件为23℃，光照/黑暗16 h/8h。

1.2 基因序列分析及系统进化树构建

从葡萄基因组网站中下载VvERF90(GSVIVT00014265001)的氨基酸序列，根据文献报道下载拟南芥ERF家族[18]、香蕉MaERF9[19]和MaERF11[15]、苹果MdERF2和MdERF3[13]的氨基酸序列。利用MEGA7软件，采用邻接法(neighbor-joining)和最短演化长度算法(minimal evolution)，构建系统进化树，bootstrap test设置为1 000。利用http://web.expasy.org/protparam/网站预测蛋白分子量及理论等电点。

1.3 引物和基因测序

本试验利用Primer Premier 5.0软件设计VvERF90基因全长扩增、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)引物和VvACO1基因的qRT-PCR引物及启动子扩增、酵母单杂交、双荧光素酶试验等引物序列，引物合成和基因测序均由上海生工生物技术有限公司完成，引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primers list

1.4 基因克隆及T载体构建

利用Ezup柱式植物基因组DNA提取试剂盒(生工，上海)和植物总RNA抽提纯化试剂盒(生工，上海)提取阳光玫瑰葡萄穗轴的基因组DNA和RNA，分别用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific，美国)和1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA和RNA的质量。以提取的RNA为模板，利用PrimeScriptTMRT reagent Kit试剂盒(TaKaRa，大连)进行反转录获得cDNA，并将其稀释至200 ng·μL-1，-20℃条件下保存备用。

基因全长扩增采用KOD OneTM PCR master Mix试剂盒(东洋纺，上海)，qRT-PCR采用TaKaRa PrimeScript RT Master Mix试剂盒(TaKaRa，大连)进行。扩增体系为50 μL：PrimerSTAR Max 25 μL；正反引物各2 μL；cDNA 2 μL；ddH2O 19 μL。PCR反应程序：98℃变性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃终延伸10 min；4℃保存。PCR产物用纯化试剂盒(D2500-1，索莱宝，北京)进行回收备用。

使用pClone007 Vector Kit试剂盒(TSV-007,擎科生物，北京)，将纯化后的PCR产物连接到pClone007载体上，反应体系为10 μL：5×Versatile Simple Vector Mix 2 μL；胶回收产物 2 μL；ddH2O 6 μL。室温(20～25℃)连接5～10 min。连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，涂板后挑取阳性克隆，进行测序检测。

1.5 酵母单杂交试验

VvERF90编码区序列连接到pB42AD载体上，VvACO1基因启动子序列连接到pLaczi载体上。将以上两种重组质粒同时转化酵母EGY48感受态细胞，并均匀涂布于缺失氨基酸SD固体培养基上(SD-Trp/Ura)，28℃培养箱中倒置培养2～3 d，然后挑取单克隆稀释点于添加X-gal的SD-Trp/Ura培养基上，观察菌落生长状态。

1.6 双荧光素酶(Dual-LUC)试验

VvERF90编码区序列构建到35 S启动子驱动的pCAMBIA307-6 myc载体上，作为Effector载体；VvACO1启动子片段构建到pGREEN-0800-LUC载体上，作为Reporter载体。将上述两种质粒同时转入GV3101农杆菌中，注射温室中生长30 d烟草叶片，具体操作方法参考文献[20]。荧光素酶活性分析利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(RG027，碧云天，上海)，在Spark酶标仪(TECAN，上海)分别测定萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，LUC)和海肾荧光素酶(renilla luciferase,REN)活性。

1.7 农杆菌介导法转化拟南芥

将VvERF90构建到pCambia1307-6 myc载体上，利用电击法转化农杆菌GV3101。将含有VvERF90::6 myc的农杆菌分别接种于5 mL含利福平和卡那霉素的液体LB培养基中，在28℃、200 r·min-1条件下振荡培养10 h，然后将菌液转移至50 mL含有相同抗生素的LB培养基28℃、200 r·min-1条件下振荡培养5 h；5 500 r·min-1离心10 min，收集菌体，用10 mL重悬缓冲液(1/2 MS，5% 蔗糖，0.03% Silwet L-77)悬浮菌体，悬浮2次后，用悬浮缓冲液稀释至OD600值为0.8。然后通过花序浸润法侵染野生型拟南芥。收获的种子记为T0代，播种在含有Kan抗生素的MS培养基平板上进行初步筛选，然后提取DNA，通过PCR鉴定阳性植株。

1.8 VvERF90和AtACO3基因的定量表达分析

提取阳光玫瑰葡萄采后贮藏第0、第3、第7和第14天穗梗的RNA以及拟南芥转基因株系和野生型株系的RNA，反转录合成cDNA，利用qRT-PCR技术检测阳光玫瑰葡萄穗梗中VvERF90基因的表达量和拟南芥中AtACO3基因的表达量，内参基因为VvActin和AtGAPDH，具体方法参照文献[21]。

1.9 数据分析

每个试验设置3个生物学重复，利用SPSS 21.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 葡萄VvERF90在穗梗褐变过程中的表达

为探明葡萄穗梗中乙烯合成的调控机制，对葡萄贮藏期间，穗梗中VvERF90的转录水平进行分析，发现VvERF90在贮藏0 d的穗梗中表达量较低，3 d时表达量升高，7和14 d时表达量逐渐降低(图1)。

图1 VvERF90在阳光玫瑰葡萄穗梗褐变过程中的表达Fig.1 Expression of VvERF90 during rachis browning of Shine Muscat grape

2.2 葡萄VvERF90的基因序列与蛋白特征分析

以阳光玫瑰葡萄穗梗cDNA为模板，VvERF90-F/R(表1)为引物进行扩增，得到VvERF90序列，测序结果显示VvERF90基因的编码序列(coding sequence，CDS)长度为807 bp，编码268个氨基酸，蛋白分子量30.0 kDa，理论等电点5.64。该基因含有ERF基因家族的AP2/ERF保守结构域(图2)。

注：黑色划线部分为AP2/ERF结构域；*表示翻译终止。Note: Black line underlined represent AP2/ERF domain. * denote translation stopped.图2 VvERF90基因序列信息Fig.2 Sequence information of VvERF90

2.3 葡萄VvERF90基因序列生物信息学分析

拟南芥中ERF转录因子家族可以分为12个亚家族，每个亚家族基因具有独特的特征[16]。本研究选择了拟南芥12个亚家族中的部分基因和苹果、香蕉中与乙烯合成相关的基因进行聚类分析，发现葡萄VvERF90和苹果MdERF2、MdERF3和拟南芥AtERF101/AtERF2、AtERF100/AtERF1聚为同一分支，均聚类在第IX ERF亚家族(图3)，VvERF90与苹果MdERF2亲缘关系较近。结果表明，VvERF90属于ERFIX亚家族，与苹果MdERF2之间可能存在功能上的相似性。

2.4 VvERF90对VvACO1启动子的调控分析

克隆含有ERF转录因子结合元件的VvACO1启动子序列，进行酵母单杂交试验，结果显示，在加有X-gal的缺失氨基酸的培养基上，VvERF90和VvACO1启动子共同转化酵母之后，菌斑可以生长并变蓝，VvERF90与pLacZi、pB42AD与pLacZi及VvACO1启动子和pB42AD共同转化酵母之后菌斑没有变蓝(图4-A)。表明VvERF90可以结合VvACO1的启动子。

为进一步验证VvERF90对VvACO1启动子转录活性的调控作用，将VvERF90构建至35 S启动子驱动的效应载体，VvACO1启动子构建至pGreen0800-LUC报告载体载体。将VvERF90和VvACO1启动子共同转化烟草叶片，检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性。结果显示，与空载体相比，VvERF90与VvACO1启动子共同转化烟草后，LUC相对活性明显升高，说明VvERF90显著提高了VvACO1启动子的活性，可以正调控VvACO1的表达(图4-B)。

图3 葡萄、拟南芥、苹果和香蕉ERF蛋白进化树分析Fig.3 Phylogenetic tree of grape,Arabidopsis,apple and banana ERF proteins

2.5 VvERF90基因在拟南芥中异位表达

为了进一步验证VvERF90在植物生长发育过程中的功能，本研究将VvERF90构建至植物过表达载体pCambia1307-6 myc，转化拟南芥。提取转基因植株的DNA，以野生型植株为对照，进行PCR检测，结果显示，转基因株系检测出与阳性质粒大小一致的条带，野生型植株中没有条带，表明目的基因VvERF90已导入拟南芥植株中(图5-A)。与野生型拟南芥植株相比，转基因株系在生长1周时，与野生型无明显区别，生长至4周时，均表现出矮化表型(图5-C)，对株高进行分析，发现转基因株系高度明显低于野生型(图5-D)。

2.6 转基因VvERF90对拟南芥中AtACO3表达和乙烯释放速率的影响

为了进一步探究VvERF90在乙烯合成中的转录调控机制，本研究测定了转化后拟南芥乙烯释放量，及VvERF90和乙烯合成相关基因的表达量。与野生型相比，VvERF90在转基因株系中的表量达较高，而对照株系中未检测到VvERF90的表达(图6-A)。转基因拟南芥植株中，乙烯合成的关键基因AtACO3(葡萄VvACO1的同源基因)基因表达量均显著升高(图6-B)。同时，转基因拟南芥的乙烯释放量显著增加，为WT的2倍(图6-C)。这些结果进一步说明，VvERF90可以通过调节乙烯合成关键基因VvACO1的表达，进而调控乙烯的合成。

3 讨论

在乙烯信号转导途径中，乙烯响应因子ERF是最下游的一类转录因子，已有研究结果显示，其家族中多个成员，例如苹果中的MdERF2[12-13]和MdERF3[14]，可以通过结合乙烯合成路径关键基因ACS和ACO启动子上的DRE或GCC-box顺式元件调节这两类基因的转录，从而调控植物乙烯合成过程。在葡萄基因组中有122个ERF转录因子[17]，本研究克隆了在阳光玫瑰葡萄采后贮藏过程中，在穗梗中表达量与乙烯释放量呈正相关的ERF转录因子VvERF90。聚类分析发现VvERF90与已报道的苹果MdERF2和MdERF3的亲缘关系较近，且ACO1基因的表达趋势与VvERF90相似，其启动子上含有ERF转录因子可以结合的DRE顺式元件，据此推测VvERF90可能与苹果MdERF2和MdERF3有相似功能。通过体内和体外试验验证检测及转基因拟南芥植株中ACO3的表达水平和乙烯释放量的测定分析，发现VvERF90可以结合VvACO1的启动子正调控其表达，从而增加乙烯的释放量。

注：A:酵母单杂交试验分析VvERF90对VvACO1启动子的结合；B:双荧光素酶试验分析VvERF90对VvACO1启动子调控的影响。**表示在P<0.01水平差异显著。下同。Note:A: Binding analysis of VvERF90 on promoter of VvACO1 by yeast one hybrid assay. B: Regulation analysis of VvERF90 on promoter of VvACO1 by Dual-LUC experiment. ** indicates significant difference at 0.01 level. The same as following.图4 VvERF90对VvACO1启动子的调控分析Fig.4 Regulation analysis of VvERF90 on VvACO1 promoter

注：A：转基因植株的PCR鉴定；B：正常条件下生长1周的转基因植株；C：正常条件下生长4周的转基因植株; D：过表达拟南芥的株高。WT：阴性对照；P：质粒对照；#：不同转VvERF90基因拟南芥株系； M：Marker 2 000。*表示在P<0.05水平差异显著。下同。Note: A: Identification of transgenic plants by PCR. B: Transgenic plants growing 1 week under normal conditions. C: Transgenic plants growing 4 weeks under normal conditions. D: Height of transgenic plants of Arabidopsis. WT: Negative control. P: Plasmid control. #: Different strains of VvERF90 over-expression. M: Marker 2 000. * indicates significant difference at 0.05 level. The same as following.图5 过表达VvERF90拟南芥阳性株系鉴定及转基因拟南芥表型Fig.5 Identification of VvERF90 overexpression and phenotype of transgenic Arabidopsis plants

图6 拟南芥中过表达VvERF90对AtACO3基因表达和乙烯释放速率的影响Fig.6 Analysis of expression of AtACO3 and production of eEthylene in over-expressed VvERF90 Arabidopsis plants

植物中ERF转录因子可以分为12个亚家族[18]，根据聚类分析的结果，VvERF90属于IX亚家族。已有研究结果显示，猕猴桃ERF IX亚家族基因AdERF11～AdERF13在果实成熟过程中，随着果实成熟表达量降低[22]，拟南芥ERF IX亚家族基因AtERF102和AtERF105参与植株的抗寒过程[23]，同时，AtERF102～AtERF105在植株的免疫过程也起着重要的作用[23-25]。AtERF1和AtORA59可能是茉莉酸(jasmonic acid,JA)和乙烯途径的关键节点基因，能提高拟南芥对腐生型病原菌的抗性[26-27]；玫瑰ERF IX亚家族基因RhERF092调控植株对乙烯的反应[28]；橡胶树HbERF-IXc5过表达可以促进植株的生长和提高植株对非生物胁迫的抗性[29]；苹果ERF IX亚家族基因MdERF2和MdERF3可以通过调控乙烯的合成调节果实的成熟进程[13]。这些研究表明，ERF IX亚家族基因参与植物生长发育及逆境胁迫的多种生物学过程。本研究中，酵母单杂交、双荧光素酶及VvERF90在拟南芥中过表达的试验结果表明，VvERF90具有调节乙烯合成的功能，与苹果[13]和香蕉[14]中的研究结果一致，可能是葡萄贮藏期间调控穗梗中乙烯生成的关键基因，而VvERF90是否与拟南芥、橡胶树及猕猴桃中的ERF IX家族基因的功能类似，参与抗逆反应或果实的成熟过程还有待进一步研究。VvERF90在拟南芥中过表达导致株高降低，与水稻[30]和小麦[31-32]中报道的ERF转录因子的功能类似。ERFIX亚家族基因在不同植物中功能研究的结果表明，ERF转录因子家族在植物生长发育过程中在功能上存在保守性。本研究结果说明VvERF90参与葡萄中乙烯的合成过程，但其在果实和采后贮藏过程中的功能还有待进一步研究证实。

4 结论

本研究克隆了葡萄ERF IX亚家族VvERF90转录因子，长度为807 bp，编码268个氨基酸，蛋白分子量30.0 kDa，理论等电点5.64；VvERF90可以结合乙烯合成关键基因VvACO1的启动子并正调控其表达，VvERF90转基因拟南芥植株矮化，乙烯释放量升高。综上，VvERF90可以调节乙烯合成途径基因VvACO1的表达。