微波萃取辅助高效液相色谱法测定新疆级外红枣中的芦丁含量

王 璐，杨滨银，王小琴，孙路明，庹见伟

（阿克苏地区疾病预防控制中心，新疆阿克苏 843000）

红枣富含红枣多糖、维生素、氨基酸、环磷酸腺苷、黄酮类化合物等生理活性物质[1-2]，其中重要的是黄酮类物质[3]，研究结果表明，生物类黄酮具有多种生物活性，因此红枣有“百果之王”的美称[4]。

芦丁是红枣中重要的活性成分之一，具有较高的医用和药用价值[5]，能降低毛细血管通透性和脆性，促进细胞增殖和防止血细胞凝聚，以及发挥抗炎、抗过敏、利尿、解痉、镇咳、降血脂等作用[6]。目前红枣是新疆林果类产业发展的重点项目之一，红枣果实在成熟期落果率达到25%，红枣的加工过程中也会产生部分级外果品[7]。级外红枣绝大多数以废物的形式丢弃或作为燃料被燃烧掉，未能实现更高附加值的资源利用。红枣芦丁的提取实现了级外果的有效利用和价值提升。

目前，红枣芦丁的测定主要有分光光度法和高效液相色谱法[8-13]，高效液相色谱对于高沸点、大分子、强极性化合物的分离分析有较大的优势；微波萃取无需干燥等预处理，简化了工艺，对天然产物的提取具有选择性高、操作时间短、溶剂用量少、有效成分得率高、浸出过程材料细粉不凝聚、不糊化等优点；二者结合能够优势互补、相辅相成。目前采用微波萃取技术提取级外红枣中芦丁含量的高效液相色谱法分析的报道较少。本文通过微波萃取前处理方法提取红枣芦丁，采用高效液相色谱仪测定红枣中的芦丁，并优化工艺条件，为充分利用红枣落枣及级外枣中的芦丁提供依据，从而充分发挥红枣的医用价值，解决红枣落枣及级外枣销售不畅的难题，同时提高了红枣收益和农民收入。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验用红枣为级外灰枣干品，产地为新疆阿克苏市。芦丁标准品，上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98.0%，CAS#153-18-4；无水乙醇，纯度99.7%，分析纯，莱阳经济技术开发区精细化工厂；磷酸，分析纯，85wt%，西亚化工技术公司（山东）；甲醇，色谱纯，99.99%，美国Fisher 公司；实验用水由Milli-Q 净化制得。

1.2 仪器与设备

HPLC 液相色谱仪，ACQuity Arc，美国Waters 公司；202 型电热恒温干燥箱，上海申光仪器仪表有限公司；BSA224S-CW 分析天平，赛多利斯科仪器有限公司；AS10200BDT 超声仪，天津奥特赛斯仪器有限公司；TGL-18MS 离心机，上海卢湘仪仪器有限公司；MARS 全自动固相萃取仪，美国GEM公司。

1.3 方法

1.3.1 红枣中芦丁的提取与分析

原料→干燥→磨粉→过筛→加乙醇浸提→在微波下萃取→过滤→氮吹浓缩→芦丁提取液→HPLC 分析

1.3.2 操作要点

将红枣样品切成细条，去核，放入50 ℃烘箱中烘干，然后粉碎过80 目筛，备用。准确称取0.300 0 g（精确至0.000 1 g）于50 mL 离心管中，加入一定量30%乙醇水溶液，微波萃取2 min，冷却至室温后用水定容至50 mL。在4 000 r/min 下离心10 min，取上清液，过0.22 μm 滤膜，HPLC 上机测定。

1.3.3 微波萃取辅助乙醇浸提技术参数优化

准确称取红枣粉0.300 0 g，萃取时间2 min，料液比1∶15 条件下，分别加入不同浓度（50%、60%、70%、80%、90%、100%）的乙醇4.5 mL，微波功率分别按功率300、350、400、450、500 W 提取，采用单因素实验分别考察乙醇浓度和微波功率。

1.3.4 HPLC 条件优化方法

影响HPLC 检测效果的因素主要有检测波长、流动相、柱温和流速，分别考察对芦丁峰面积的影响。采用二极管阵列检测器对波长进行考察，选择247～358 nm 波长范围进行全波长扫描；分别以甲醇-水溶液、甲醇-0.5%磷酸水溶液和乙醇-0.1%磷酸水溶液作为流动相，设置不同配比（30∶70、35∶65、40∶60、45∶55）；柱温采用30、40、50 ℃三个水平，流速采用0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min 四个水平，对标准品溶液进行测定。

1.4 测定指标与方法

参照中国药典和其他文献[14-15]，精密吸取对照品溶液与红枣提取液注入高效液相色谱仪中，采用外标法测定芦丁含量。根据标准曲线方程计算红枣样品液中芦丁的质量浓度，并根据公式（1）计算其芦丁的得率Y。

式中，Y为芦丁的得率,%；M为样品溶液中芦丁的质量，mg；m为用于提取的枣粉质量，mg。

1.5 数据处理

所有数据均重复测定3 次，取平均值。芦丁含量采用的外标法，通过液相色谱仪相配套的Empower 3 色谱数据处理软件完成相关成数据采集与处理，采用Excel 97-2003 数据处理软件对数据进行绘图。

2 结果与分析

2.1 微波辅助乙醇提取条件的选择

2.1.1 乙醇浓度的选择

如图1 所示，随着乙醇浓度的增加，芦丁提取量先增加后减少，当乙醇浓度为70%时，芦丁提取量最大，为0.262 g/100 g。因此，乙醇浓度选择70%。

图1 乙醇浓度对芦丁含量的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on rutin content

2.1.2 微波功率的选择

如图2 所示，随着微波功率的增大，芦丁含量先增加后减少，当微波功率为400 W 时，芦丁含量最高，为0.264 g/100 g。因此，微波提取功率选择400 W。

图2 微波功率对芦丁含量的影响Fig.2 Effect of microwave power on rutin content

2.2 HPLC 条件的选择

2.2.1 检测波长的选择试验测得最佳吸收波长为274 nm，峰面积最高为124 238，灵敏度最高。因此检测波长选择274 nm。

2.2.2 流动相的选择

由色谱峰出峰时间结果显示，单标芦丁溶液的保留时间随流动相组成变化有较大变化，流动相中甲醇比例从45%降到30%时，芦丁保留时间从6.04 min 延长至21.25 min，说明流动相中甲醇比例降低，流动相极性增强，延长了芦丁的出峰时间。陈静等[16]在研究甲醇流动相比例对芦丁出峰影响时得出，当甲醇比例从60%降至30%时，芦丁组分的保留时间延长了21 min，与试验结果变化趋势相似。考虑到红枣中含有色素较多以及组分的复杂性，芦丁的保留时间以12 min 左右较宜，故选择流动相组成为甲醇-0.5%磷酸水溶液=40∶60。

2.2.3 色谱柱柱温的选择

在柱温为30、40、50 ℃条件下，对红枣芦丁提取液进行分析得出，随着柱温的增加，柱压下降，洗脱效率增强，芦丁出峰时间提前，柱温过高影响仪器和色谱柱的寿命。因此柱温选择40 ℃。

2.2.4 流速的选择

流速过高，不但不利于仪器和色谱柱的保护，同时造成流动相的浪费；流速过低，芦丁的出峰时间延长。本实验在流速0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min 条件下测得在流速为0.8 mL/min 时，得到的色谱峰出峰时间和灵敏度最好，故流速选择0.8 mL/min。

2.3 样品的测定

精确称取同一批次级外红枣样品6 份，按最佳的色谱条件，即色谱柱为Waters SunFire C18（4.6 mm×250 mm×5 μm）；在检测波长为274 nm，用甲醇-0.5%磷酸水溶液（40∶60）为流动相，流速为0.8 mL/min，柱温为40 ℃，分别制备供试样品溶液，进样量1 μL，测定各样品溶液芦丁峰面积，芦丁提取量最高为0.264 g/100 g，计算芦丁含量间的RSD 为2.6%，表明该方法可以作为提取红枣中芦丁的色谱方法且重复性良好。

3 方法学考察

3.1 标准曲线及线性范围

准确称取一定量的标准品于105 ℃下干燥至恒质量，并于干燥器内冷却至室温，精确称取标准品0.010 0 g，用甲醇溶液分3 次洗涤烧杯，并移入10 mL 容量瓶中，配制成1 000 mg/L 的标准储备液。

表1 芦丁加标回收率和相对标准偏差Table 1 Recovery and relative standard deviation of rutin

精密量取芦丁标准溶液0、50、100、150、200、300、400 μL，用甲醇定容至1 mL，混匀进行测定。以峰面积为纵坐标，以芦丁进样浓度为横坐标，进行线性回归，得到回归方程为Y=-6.35×10-2X+2.32×10-3，R2=0.9992；芦丁对照品浓度在50～400μg/mL范围内呈现良好的线性关系。

3.2 精密度

用空白样品配制浓度范围为50 μg/mL 的基质溶液连续进样5 次，芦丁相对标准偏差RSD 为0.633%，小于5%（n=5），表明仪器精密性良好。

3.3 加标回收率

用空白样品配制浓度范围为0～400 μg/mL 的基质标准工作曲线，分别进行20、50、100 mg/kg 的添加回收试验（n=6）。利用添加水平50 mg/kg 的测量结果计算检出限和定量限，以信噪比S/N=3 确定方法检出限为1～5 mg/kg；以信噪比S/N=10 确定方法定量限为20～50 mg/kg。芦丁在3 个不同添加水平下，回收率介于90.1%～98.5%之间，相对标准偏差（RSD）均小于20%。

4 结论

此次试验建立了高效液相色谱法测定红枣中芦丁的方法，通过优化微波强化提取条件，建立了经济、快捷的微波强化前处理方法，建立色谱条件为以甲醇-0.5%磷酸（40∶60）为流动相，在柱温为40 ℃、用70%的乙醇1∶15 的料液比、400 W 的萃取条件下，红枣中的芦丁提取量最高为0.264 g/100 g，比赵志勇等[9]在响应面法优化新疆红枣总黄酮乙醇提取工艺中提取得到芦丁含量稍高，说明微波强化前处理比传统的前处理更为快速简单、稳定高效。试验结果表明HPLC 方法测得芦丁浓度为50～400 μg/mL，芦丁浓度与峰面积线性关系良好，精密度、稳定性良好，样品回收率介于90.1%～98.5%之间，芦丁在3 个添加水平的相对标准偏差（RSD）均小于20%（n=6）。总体上该方法简单、快速、准确度高、精密度好，完全能够满足红枣中芦丁成分测定的需求，可以为新疆级外红枣的综合利用及其深加工技术的开发提供一定的理论依据。