酵母β-葡聚糖提取方法及免疫活性研究

吴豪益，王彦波，傅玲琳，刘福奇，韩军花

（1.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江 杭州 310018；2.浙江工商大学实验室与资产管理处，浙江 杭州 310018；3.美赞臣婴幼儿营养品研发中心（中国）有限公司，广东 广州 510623）

β-葡聚糖是一类天然多糖，由D-葡萄糖单体通过β-糖苷键连接而成，作为细胞壁的重要结构元件，在细菌、真菌（包括酵母）、藻类和植物中广泛存在。研究发现，β-葡聚糖的理化性质及生物活性均与其分子空间结构密切相关[1]。不同来源的β-葡聚糖以及不同的提取、纯化方法都会影响其分子结构，进而影响相应的生物活性[2-3]。研究显示，来源于啤酒酵母的酵母β-葡聚糖（yeast β-glucan）在 β-1，3 主链上有高度支链度，分子量比较大。并且其表现出增强机体免疫能力、调节血糖和肠道微生态的生理作用，因此被认为是一种安全天然有效，具有免疫调节的功能食品原料[4]。

酵母β-葡聚糖在2008年获得美国食品药品管理局的食品安全性认证（Generally Recognized as Safe，GRAS）（GRN00239），随后常被用于支持健康免疫功能的功能性食品、饮料、保健食品和运动营养产品。中国卫生部发布的《中华人民共和国卫生部公告2010年第9号》公告，认定酵母β-葡聚糖为新资源产品，可以添加到乳制品、功能饮料、焙烤制品、糖果等各种食品中。2012年第6号公告已将酵母β-葡聚糖使用范围扩大至婴儿配方乳粉，本文为其在食品领域的发展和应用提供了参考。

1 酵母β-葡聚糖的制备

1.1 酸碱法

酸法和碱法是最早应用于酵母β-葡聚糖浸提的方法之一。在早期的研究中，一般使用醋酸、甲酸等有机酸在90℃左右的条件下对酵母细胞水浴3 h左右，再经过离心、沉淀以及干燥等操作得到酵母β-葡聚糖产物[5-6]。黄丹等[7]研究发现，使用酸法得到的产物虽然产率较高（21.58%），但是纯度较低，虽然经过一系列的优化但纯度（71.46%）仍无法提高到理想程度。而在对碱法提取的研究中，使用NaOH处理酵母细胞，并辅以高压等手段，使所得产品纯度达到90%以上，满足食品以及医疗等领域的要求。但碱法过程中产生的废液难以处理，限制了其在大规模生产中的应用[8-9]。为将酸碱两种提取方式的优势结合起来，于明秀和Pengkumsri等[6，10]对酸碱结合的方法进行探究及优化，将酵母细胞自溶后，先后用强碱（NaOH）和弱酸（CH3COOH）处理，所得的酵母β-葡聚糖产品的得率和纯度都较单独处理的酸法和碱法有提升，且产品改性后能满足医疗领域的需求。但是由于酸碱废液的环境污染问题仍然无法达到有效的改善，且由于过程中使用大量的酸碱造成提取成本的增加。因此，酸碱法处理无法满足目前食品以及药品市场对酵母β-葡聚糖的需求，也无法满足市场对绿色生产的要求。

1.2 高压微射流均质法

高压微射流均质法（high pressure microfluidization，HPM）作为一种比较新兴的食品加工处理手段，在酵母β-葡聚糖提取的应用中也表现出良好的效果。HPM利用高压使液体物料被泵入并分成两个微流，随后在一个反应腔室发生相互碰撞，使微粒受到强烈的剪切、撞击及空穴效应，使得细胞破碎、内容物溢出，实现对细胞内化合物的高效提取[11-12]。Williams等[13]用HPM技术从酿酒酵母中提取β-葡聚糖，在保持其生理活性的同时能够显著降低其分子量，获得溶解度更好的高品质产品。Liu等[14]对HPM过程中的最佳处理条件进行探索，发现随着HPM压力升高可以明显提高可溶性β-D-葡聚糖的产量，在压力达到165.48 MPa时，提升效果最佳。在腔室压力为165.48 MPa、停留时间为10 min/200 mL的条件下制得的β-葡聚糖产品不仅产量和纯度优于传统酸碱浸提法，且可溶性更佳，蛋白质含量更低，适用于产业化生产[15]，HPM技术与其他方式优化组合后，较单一的提取方法在提取效率、得率和纯度上显著提高。高洁等[16]在前期研究的基础上，采用高压微射流均质与复合酶解结合的方法制备酵母β-葡聚糖，见图1，高压微射流1处理条件：压力210 MPa、循环3次、质量浓度20%（湿重）；复合酶解条件：酶添加量1.0%、温度55℃、pH7.0、酶解50 min、料液比湿重（质量比）1∶4；高压微射流2处理条件：压力210 MPa、循环3次，制得的酵母β-葡聚糖产物纯度为（81.07±0.82）%，总糖含量为（91.51±1.60）%，基本可以达到工业化生产的纯度和得率要求。但是可能由于过程中的高压环境使得酵母的立体结构被破坏，得到的酵母β-葡聚糖产物为粗糙扁平状，这对葡聚糖的功能效果可能会产生一定的影响。

图1 高压微射流均质与复合酶解结合方法Fig.1 The method of combining HPM and compound enzymatic hydrolysis

1.3 超声波法

目前，超声波技术作为一种非热加工技术，由于其空化效应能够有效地增强物质的提取分离效果，作为一种辅助提取手段在对天然产物和生物活性物质的提取中表现出巨大的潜力[17]。早期研究采用超声波技术处理酵母泥，多糖得率能够达到33%～36%，远高于传统酸碱法20%左右的多糖得率。在此基础上，李红梅等[18]利用Box-Behnken优化超声波辅助提取技术中的关键因素，如处理时间及超声功率，采用的自溶超声波耦合技术在提取酵母β-葡聚糖时提取率达到50.5%。自溶超声耦合技术在超声技术的基础上利用酵母细胞在特定环境下的自溶，破坏细胞结构，与超声辅助提取效果起到协同效果。Zheng和Kim等[19-20]发现，超声波处理与碱处理分别使酵母β-葡聚糖的粒径从 8.80 μm 减少到 1.77 μm 和 7.19 μm，相比于碱处理，超声波处理在松动葡聚糖聚集结构，扩大比表面积，增强其可溶性方面有更大的优势。当超声波技术与酶解相结合处理时，前者通过增大酶接触面积大大增强了酶解效率，使酵母β-葡聚糖的产率提高到32.3%，纯度达到98.8%，远超于单一处理模式[21]。超声与上述辅助手段的联合处理得到的酵母β-葡聚糖产物在结构和生物活性保留上有较大的改善。可见，这类提取方式是酵母β-葡聚糖在工业中高效提取的潜在方法。

2 酵母β-葡聚糖免疫活性

2.1 基于细胞模型研究

在体外研究中，酵母β-葡聚糖表现出对免疫细胞、受体及细胞因子等参与免疫系统因子的调节作用。Angulo等[22]利用酵母β-葡聚糖刺激山羊的单核细胞，在培养4 d～6 d后，表现出典型的巨噬细胞形态，且上调了巨噬细胞表面标志物（CD11b和F4/80）的基因表达，从而在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）攻击下发现了增强的细胞存活和高吞噬能力。在前期的一些研究中发现，酵母β-葡聚糖在体外表现出促进脾脏淋巴细胞增殖的作用，且有助于白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-10（interleukin-10 IL-10）、肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）等细胞因子的产生[23-24]，对免疫效果有显著的增强作用。此外，在已有的研究报道中，酵母β-葡聚糖表现出与抗肿瘤单克隆抗体的协同作用，对抗肿瘤效果及多种凋亡调节蛋白水平有显著的改善。酵母β-葡聚糖可以直接抑制癌细胞的生长，也可以刺激自然杀伤细胞或中性粒细胞在与葡聚糖受体结合时杀死癌细胞[25]。在近期研究中发现，酵母β-葡聚糖作为一种新型的自噬抑制剂在癌症治疗方面取得了进展，其通过增加溶酶体pH值和抑制溶酶体组织蛋白酶活性来抑制自噬降解，从而对肝癌细胞的增殖和代谢以及体内肿瘤的生长表现出显著的抗肿瘤作用[26]。

2.2 基于动物模型研究

目前酵母β-葡聚糖在很多动物试验研究中表明，其在提高机体免疫能力、抗肿瘤等方面有显著的效用，被用作动物免疫刺激剂。Wang等[27]在研究中发现，口服硫酸化的酵母β-葡聚糖通过显著改变细胞因子的浓度，提高 γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）和 IL-6浓度，降低转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）浓度，促进淋巴细胞增殖从而有效改善鸡的免疫系统，同时增加有益的肠道细菌，促进肠道免疫系统的功能。利用口服插管方式对鳎鱼模型进行酵母β-葡聚糖给药，通过取血分析和对鱼肠道菌群的16S rDNA组学测序，结果表明鱼肠道IL1B和IRF7表达上调且肠道微生物中的弧菌比例显著降低，实现对模型免疫的调节[28]。并且当酵母β-葡聚糖作为补充物添加于饲料中时，能够有效提高养分消化率，通过增加免疫球蛋白浓度和刺激碱性磷酸酶来增强免疫力[29]，在提高机体先天性免疫力和特异性病原体抵抗力方面体现了良好的应用前景。在小鼠模型的研究中发现，酵母β-葡聚糖能够有效预防小鼠单增李斯特菌、炭疽芽孢杆菌以及白色念珠菌的感染[30-31]。Chan等和Alexander等[32-33]基于之前所报道的抗肿瘤机制，证明了酵母衍生的β-葡聚糖颗粒在小鼠肺部转移样黑色素瘤模型中的抗肿瘤功效。近期有研究表明，酵母β-葡聚糖与锌复合后的产物在纳米载体递送下对机体的抗炎和促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8）有明显的增强作用，对提高机体体液免疫、自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）活性，增强肠黏膜免疫有显著调节作用[34-35]。

2.3 基于临床研究

近年来，酵母β-葡聚糖在临床人体免疫方面的应用也受到学者的关注。研究表明，针对不同年龄阶段人群的双盲选实验中，摄入酵母β-葡聚糖的受试人群较安慰剂对照人群，皮肤和呼吸道的过敏症状等发生率有显著降低[36-38]。尤其在幼儿期方面以及中老年人方面表现出显著的提高机体免疫力的效果，在对1岁～4岁儿童的喂食实验中，摄入含酵母β-葡聚糖乳品饮料的实验组受试结果显示其过敏性鼻炎、喘息，过敏性咳嗽、湿疹和荨麻疹等发生率与对照组相比有显著降低且需要接受抗生素治疗的比例减少[39]。Fuller等[36]在针对50岁～70岁中老年人范围的研究中发现，每天服用250 mg酵母β-葡聚糖胶囊虽然没有显著的统计学差异，但是能够有效降低发生感染症状的天数，同时改善情绪状况，缓解情绪压力。但是对于酵母β-葡聚糖在人体中调节的具体机制还不清晰，待进一步的研究。

2.4 免疫活性机制

酵母β-葡聚糖由于其显著的免疫调节作用而受到广泛的关注，酵母β-葡聚糖免疫活性机制见图2。酵母β-葡聚糖进入消化道后，通过食道和胃进入小肠。在肠壁上的M细胞将β-葡聚糖从肠腔转运到淋巴组织[40]，该区域富含免疫细胞，例如巨噬细胞和树突状细胞，可连续监测通过肠道的成分，尤其是有害微生物。巨噬细胞和树突状细胞在其外表面具有专门的受体，可以识别并结合有害微生物中常见的分子结构[41]。以巨噬细胞为例，由于酵母β-葡聚糖分子特殊结构，会被巨噬细胞上的受体识别后结合，并由此激活巨噬细胞，并使其具有破坏有害微生物的能力[42]。小鼠体内实验显示，喂养酵母β-葡聚糖的个体内粒细胞和单核细胞具有更高的吞噬活性及吞噬细胞的百分比[40]，可见酵母β-葡聚糖对这些细胞类型的氧化代谢产生了积极的作用，这是一种强烈的呼吸爆发刺激。利用致敏蛋白刺激淋巴细胞时，来自酵母β-葡聚糖喂养组的淋巴细胞具有较高的增殖率[43]，这也证明了酵母β-葡聚糖对细胞免疫的积极影响。此外，尽管酵母β-葡聚糖开始在肠道中发挥作用，但也有研究表明，酵母β-葡聚糖分子可以被巨噬细胞转运至体内其他部位的淋巴组织，从而可以激活其他免疫细胞[40]。而由于酵母β-葡聚糖被免疫细胞上受体所识别并结合是具有专一性的，因此具有不同分子结构的β-葡聚糖在免疫系统的作用也不同，具体的免疫机制仍需要进一步的探索。

图2 酵母β-葡聚糖免疫活性机制Fig.2 Yeast β-glucan immune activity mechanism

3 结论与展望

目前，酵母β-葡聚糖在化工、水产以及食品方面的应用受到越来越广泛的关注。调查数据显示，到2022年，全球酵母β-葡聚糖市场将达到4.765亿美元，这表明β-葡聚糖的应用具有巨大的发展潜力。但是在国内市场中，酵母β-葡聚糖仍然存在产量低、品质不高等问题，无法满足市场日益增长的需求。目前常用的提取手段包括酸碱法提取、高压微射流均质法以及超声辅助提取法，这些方法都还存在产率低、纯度难以满足市场需求、生产过程污染严重等问题。寻找一种工艺简单、产量高且产品质量良好的生产方式有助于提高酵母β-葡聚糖商业价值，推广其在各领域的应用，顺应其国际发展趋势。目前在细胞模型、动物模型和初步临床上对酵母β-葡聚糖进行了一系列研究，β-葡聚糖均表现出了提高机体免疫能力的作用。但是其对机体免疫调节的具体机制还存在一些疑问，某些提出的机制仍基于假设，尚未阐明潜在的作用机制。未来的研究应集中在探索酵母β-葡聚糖与不同主体之间的深层相互作用机制，以及不同机制之间的相互联系。这对于了解人和动物中酵母β-葡聚糖引起的变化将是有益的，这也将有助于酵母β-葡聚糖的开发和应用。