不同光强光质对艾草生长及挥发油成分积累的影响

褚宏叶，周帅奇，李春雨，吴 端，叶磊明，谢思琪，赵德刚，沈 奇*

(1. 贵州大学生命科学学院 / 农业生物工程研究院 / 山地植物资源保护与保护种质创新教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；2. 广州中医药大学中药学院药用植物生理生态研究院，广东 广州 510006)

艾(Artemisia argyi)又名艾蒿、灸草，为菊科蒿属多年生草本植物[1]。艾具有易于栽种、资源丰富、分布广泛等特点，在中国、韩国、日本等多个国家均有生长，在中国有着悠久的应用历史。艾叶是艾的干燥叶，是常用中药，具温经止血、散寒止痛等功效及多种药理活性，广泛用于医疗、食品等行业[2]。研究表明，艾叶有效成分主要为挥发油类、黄酮类、桉叶烷类和三萜类化合物等[3—6]。其中最受关注的是艾叶挥发油，具有抗菌、抗炎、解热镇痛等多种药理作用[7—10]。艾叶挥发油的主要成分有桉油素、樟脑、龙脑、蒎烯、萜品烯等，其中桉油素是2020版《中国药典》中规定的艾叶指标性成分。艾叶挥发油对多种农业害虫具有很好的毒杀和驱避毒性[11]，可开发成天然杀虫剂、抗菌剂、保健食品和药品等[12]。艾的开发及经济价值备受国内外关注。

光是环境因素中对植物生长发育影响最为重要的因子之一，对植物营养代谢及生殖发育具有显著影响。光可直接或间接地调控植物的光形态建成、生长发育和生理代谢等生命活动[13—14]。合理地调配光质，可以强化植物体营养吸收及物质转化。挥发油作为植物次生代谢物，其组成及含量与气候因子等环境条件有较大相关性。据报道，不同生长的环境，光照及温度等均对艾叶中挥发油成分和含量有显著影响[15—17]。目前，对于光与艾的生长、活性成分及其关键酶基因表达量之间的关系鲜有报道。因此，本研究从产量、质量和基因表达层面探究不同光强光质处理对艾草生长及其主要挥发油成分影响，旨在确定艾的适宜栽培光条件，进而提高艾叶产量及品质。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

实验样品均来自实验室培养的蕲艾组培苗。桉油素等标准品购于上海源叶生物科技有限公司。

1.1.2 仪器

Agilent 6890/5973气相-质谱-计算机联用仪(美国安捷伦公司)、KQ-200DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、电子天平(瑞士苏黎世梅特勒-托利多集团)、高速离心机(巩义市宏华仪器设备工贸有限公司)、VQ-GLT8020 型 LED 灯管(规格 T8 1.2 M 20 WLED)(深圳市泛科科技有限公司)、植物强光培养箱(Percival E-36 L, 美国)。

1.2 方法

1.2.1 光质处理

设置光处理为高光强(H，光照强度1000 μmol·m–2·s–1)、红光(R，波长 615～650 nm)、蓝光(B，波长450～480 nm)，以白光(W，波长450～465 nm)为对照，将蕲艾组培苗分组定植于不同光处理下，设3次重复。各处理光照时间均为12 h·d–1。温度25 ℃，处理14 d后取样。

1.2.2 表型评价

取红光、蓝光、高光强、白光处理14 d的艾草，测量其株高、单株生物量、地上部分生物量、根重。株高采用直尺测量(mm)，单株生物量、地上部分生物量及根重采用电子天平(精确度0.001 g)称量。

1.2.3 挥发油含量评价

采用有机溶剂萃取法提取挥发油。准确称取0.2 g艾叶，研磨后加入1.5 mL正己烷，超声30 min，期间振荡 3 次，12000 r·min–1离心 5 min，吸取上清，加入适量无水硫酸钠，静置1 h，12000 r·min–1离心5 min，吸取1 mL上清，过0.22 μm有机滤膜，挥干后加500 μL正己烷，进样检测。

对照品标准溶液制备[18]：称取1,8-桉油素10 mg用甲醇配制成标准工作溶液浓度 0、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mg·mL–1。采用以下的色谱条件，以 1 μL 进样量进行气相色谱分析测定。

挥发油成分检测色谱条件：RXT-5MS石英毛细管柱(30 m × 0.25 μm × 0.25 μm)；柱前压 63.9 kPa；不分流；进样量500 μL；进样口温度260 ℃；载气He；柱温 80 ℃，保留 1 min，其后以 15 ℃·min–1速率升温至300 ℃，保留15 min[19]。质谱条件：电离方式EI，灯丝电流0.5 mA；电子能量70 eV；倍增器电压0.86 kV；离子源230 ℃，溶剂延迟1 min；质核比(m/z) 40～500。

使用 NIST标准谱库自动检索各成分的判定物质，采用面积归一法计算其相对含量，根据标准品浓度曲线，采用外标一点法计算各物质绝对含量。

1.2.4 艾草中光响应基因表达检测

采用植物总 RNA提取试剂盒提取艾草叶组织总RNA。利用NanoDrop 2000检测仪测定RNA浓度电泳检测完整性。采用反转录试剂盒将总RNA逆转录合成cDNA。

通过同源比对分别鉴定艾草中红光/远红光受体基因PhyA、PhyB/D，蓝光受体隐花色素基因CRY1、CRY1-1、CRY2和向光素基因Phot1、Phot2及重要的光响应转录因子 HY5的序列信息。采用Primer 5.0 软件设计qRT-PCR 扩增引物，引物合成委托上海生物工程技术有限公司进行。

以艾草组织cDNA为模板，actin为内参基因，采用RT-PCR检测表达量。PCR反应体系：SYBR®Premix ExTaqTM 5 µL，正反引物各 0.3 µL，cDNA模板 4.4 µL，共 10 µL。RT-PCR 反应程序：95 ℃预变性 3 min，95 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸20 s，反应40个循环。重复3次，结果采用2-ΔΔCt法分析。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for fluorescent qRT-PCR

1.2.5 数据统计分析

采用 Excel 2013对数据进行绘图分析，SPSS 25.0软件进行数据分析和图表制作。

2 结果与分析

2.1 不同光强光质对艾草生长的影响

2.1.1 植株高度

高光强处理下艾草的株高略有降低，叶片增大；在蓝光及红光处理下，茎节伸长明显，株高增加(图1)。高光强处理下艾草株高(5.51±0.11 cm)较对照(7.08±0.11 cm)降低约22.17%；红光下，艾草株高(10.94±0.02 cm)较对照(7.08±0.11 cm)增高 54.52%，差异极显著；蓝光下株高(10.34±0.06 cm)较对照(7.08±0.11 cm)增高 46.04%，差异极显著(图2A)。结果显示，高光强处理抑制艾草植株伸长，蓝光及红光处理可促进艾草植株伸长。

图1 光强和光质对艾草表型的影响Fig. 1 The effect of light intensity and light quality on the phenotype of Artemisia argyi

图2 光强和光质对艾草生物量的影响Fig. 2 The influence of light intensity and light quality on Artemisiae argyi

2.1.2 单株生物量

不同的光强和光质处理艾草后，植株单株生物量发生较大改变。处理14 d后，高光强下艾草单株重量(1.04±0.02 g)较对照(0.96±0.02 g)增加 8.33%；红光下艾草单株重量(0.98±0.02 g)较对照(0.96±0.02 g)增加2.08%；蓝光下单株重量(1.15±0.03 g)较对照(0.96±0.02 g)增加19.79%(图2B)。由此可见，高光强、蓝光及红光处理均可促进艾草单株重量有一定程度的增加。

2.1.3 地上部分重量

高光强和不同光质处理处理14 d后，高光强下艾草地上部分重量(0.78±0.02 g)较对照(0.58±0.01 g)增加34.48%；红光下艾草地上部分重量(0.59±0.02 g)较对照(0.58±0.01 g)增加1.72%；蓝光下艾草地上部分重量(0.82±0.02 g)较对照(0.58±0.01 g)增加 41.38%(图2C)。由此可见，高光强及蓝光处理均有效促进艾草地上部分重量增加。

2.1.4 根部重量

高光强和不同光质处理艾草后，植株根部重量发生显著改变。处理14 d后，高光强下艾草根部重量(0.26±0.02 g)较对照(0.38±0.01 g)降低 31.58%；红光下艾草根部重量(0.39±0.01 g)较对照(0.38±0.01 g)增加2.63%；蓝光下艾草根部重量(0.33±0.01 g)较对照(0.38±0.01 g)降低 13.16%(图2D)；由此可见，红光处理能一定程度促进艾草根部重量增加，高光强和蓝光处理抑制艾草根部增长。

2.2 不同光强光质对艾叶挥发油成分的影响

2.2.1 挥发油成分定性分析

不同光质处理对艾叶挥发油的组成有一定影响。从几种光质处理的艾叶中共鉴定出20种挥发油类物质，主要包括1,8-桉油素、β-萜品醇、樟脑、异龙脑、菊油环酮等单萜类物质、蓝桉醇等倍半萜类及少量脂类、醚类、酮类物质(图3、表2)。

图3 不同光强光质处理艾叶挥发油GC-MS总离子流及特征离子峰Fig. 3 GC-MS total ion current and characteristic ion peaks of volatile oil of Artemisiae argyi treated with different light intensity and quality

表2 艾叶挥发油主要成分含量Table 2 Content of main components of volatile oil from Artemisiae argyi folium

2.2.2 不同光强光质处理艾叶挥发性物质差异分析

在不同光强和光质处理下，艾叶挥发油含量及产物发生明显改变。高光强、红光及蓝光处理促进艾叶挥发油中1,8-桉油素、β-萜品醇含量显著提高，马鞭草烯醇含量显著降低，并检测到白光条件下未检测到的 4-萜烯醇。在高光强处理下，β-萜品醇、龙脑含量显著提高，分别为 0.0158 mg·mL–1、0.0205 mg·mL–1，分别达对照的 4.5倍、2.4倍，并检测到白光条件下未检测到的反式-松香芹。红光处理下，菊油环酮含量显著提高，为0.0158 mg·mL–1，是对照的1.8倍。蓝光处理下，1,8-桉油素、反式-2-降冰片醇、樟脑、二苯醚含量显著提高，分别为0.0601 mg·mL–1、0.0514 mg·mL–1、0.0618 mg·mL–1、0.0613 mg·mL–1，是对照的 6 倍、1.8 倍、2 倍、3.8倍，并检测到在其他光照条件下未检出的萜烯、异龙脑和蓝桉醇。

2.3 光照对艾叶关键基因表达量影响

2.3.1 关键酶基因表达量

采用实时荧光定量PCR方法检测艾叶中红光/远红光受体基因PhyA、PhyB/D，蓝光受体隐花色素基因CRY1、CRY1-1、CRY2和向光素基因Phot1、Phot2及重要的光响应转录因子HY5等基因在不同光处理中的表达量。结果显示，高光强下光受体相关基因表达量均显著升高，Phot1响应上调倍数最高，达到对照的1169.37倍，其他基因按照表达量提高程度依次为CRY1、HY5、PhyA、CRY1-1、Phot2、CRY2、PhyB/D，分别为对照的177.74倍、168.37倍、138.00倍、43.54倍、19.31倍、11.14倍、2.02倍。此外，红光条件下，基因CRY1、CRY1-1、Phot1表达量均有所提高。蓝光条件下，蓝光受体基因Phot1表达量有所提高，为对照的2.95倍(图4)。

图4 不同光处理艾中关键酶基因荧光定量PCR表达分析Fig. 4 Quantitative PCR analysis of key enzyme genes in Artemisiae argyi treated with different light

2.3.2 生物量与其合成关键酶基因表达量的相关性分析

将艾草生物量与光受体的相关基因表达量进行相关性分析。结果显示，光受体基因及重要的转录因子与艾草株高及根重均呈负相关。其中，蓝光受体基因CRY1、CRY1-1及向光素基因Phot1、Phot2表达量与株高、根重呈负相关，与单株重量、地上部分重量呈正相关；蓝光受体基因CRY2表达量与株高、单株重量、根重呈负相关，与地上部分重量呈正相关。红光受体基因PhyB/D表达量与株高、单株重量、地上部分重量呈负相关，与根重呈正相关。红光受体基因PhyA表达量与株高、单株重量、根重呈负相关，与地上部分重量呈正相关(表3)。尤其是重要的光响应转录因子HY5表达量与单株重量呈显著正相关，与地上部分重量呈极显著正相关，说明光响应的转录因子调控可能对艾草生物量的影响起重要作用。综上，艾草生物量的积累受不同光处理调控，是通过光受体响应调控艾草生长。

表3 艾草生物量与关键酶基因表达量的相关性分析Table 3 The correlation analysis between the expression of photoreceptor-related genes and the biomass in Artemisiae argyi

2.3.3 挥发油含量与其合成关键酶基因表达量的相关性分析

将艾草主要的挥发油成分与光受体相关基因进行相关性分析。结果显示，蓝光受体基因CRY1、CRY2、CRY1-1及向光素基因Phot1、Phot2基因表达量与 1,8-桉油素、樟脑含量呈显著负相关，尤其是CRY2与CRY1基因表达量与樟脑呈显著负相关，与龙脑、β-萜品醇、马鞭草烯醇含量呈正相关，尤其是龙脑呈显著正相关。红光受体基因PhyB/D基因表达量与1,8-桉油素、樟脑、龙脑、β-萜品醇含量呈负相关，与马鞭草烯醇含量呈显著正相关。红光受体基因PhyA基因表达量与1,8-桉油素、樟脑含量呈负相关，与龙脑、β-萜品醇、马鞭草烯醇含量呈正相关。光响应转录因子HY5表达量与1,8-桉油素、β-萜品醇含量呈正相关，与樟脑、龙脑含量呈显著正相关，与马鞭草烯醇含量呈负相关(表4)。光受体相关基因响应不同光处理表达，表达量与挥发油成分之间存在显著相关性。说明挥发油合成受不同光处理调控，可通过光受体响应调控相关基因表达，调控艾叶挥发油的合成。

表4 艾叶挥发油成分与关键酶基因表达量的相关性分析Table 4 The correlation analysis between the expression of photoreceptor-related genes and volatile oil content in Artemisiae argyi

3 讨论

光是植物生长发育的基本环境因素。它不仅是光合作用的基本能源，也是植物生长发育的重要调节因子[20]。光照强度是影响植物光合作用的重要参数之一，对植物营养组成具有显著影响，光强低于光合补偿点，会抑制植物生长；光强高于光饱和点，会对植物的生长造成胁迫作用[21]。光质具有一定的特异性，不同波长的光所含能量大不相同。植株叶片和胚轴的延伸需要红光[22]，蓝光直接或间接影响胚轴伸长、酶调节和合成、气孔张开、叶绿体合成和光形态建成[23]。目前，植物种植工厂广泛应用LED人工光源实现高产高效栽培，降低生产成本。通过调节 LED 灯光质及光强等调控植物生长，已成功用于多种植物栽培[24]。

本研究采用不同光强及光质对艾草处理14 d，高光强对艾草生物量及地上部分重量有显著促进作用。蓝光对艾草茎有显著促进作用，对生物量及地上部分重量也有显著促进作用。红光促进茎的生长，但对生物量积累促进作用不大。通过光质优化处理，可增加艾草株高，进一步提高艾草产量。光对药用植物次生代谢产物合成过程中关键酶基因的表达量具有积极作用，且受环境因子影响较大[25—26]。不同光强和光质处理下，艾叶挥发油成分含量发生显著变化。高光强、红光及蓝光处理均可提高艾叶挥发油中1,8-桉油素、β-萜品醇含量。此外，高光强还显著提高艾叶挥发油中龙脑含量，提升其应用价值[27]。红光处理下菊油环酮含量显著提高，菊油环酮是具挥发性香气的化合物，有增强成骨细胞碱性磷酸酶活性和促进细胞胶原合成及钙沉积的作用[28]。蓝光处理下，艾叶挥发油成分 1,8-桉油素、樟脑等含量显著提高，并检测到萜烯、异龙脑和蓝桉醇等物质。樟脑具有通关窍、利滞气、辟秽浊、杀虫止痒、消肿止痛等功效，是艾叶挥发油的主要功能化合物[29—30]。蓝桉醇属于倍半萜类化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗癌等多种药理活性[31]。综合分析，适宜的光质光强处理有利于艾有效代谢物的生成。其中高光强和蓝光处理下，艾草的生物量及有效代谢物提高较多，可在艾草栽培中加以应用。

植物主要通过光受体感知并传递光信号[32]。高光强下艾叶光受体相关基因表达量均显著升高，其中向光素基因Phot1上调倍数最高。蓝光处理下Phot1表达量有所提高。一般光强高于光饱和点时对植物生长有胁迫作用，但在艾草中高光强(1000 μmol·m–2·s–1)长时间处理(14 d)不仅提高艾草生物量和有效代谢物积累，所检测的光受体基因也显著上调表达。说明适度高光强胁迫对提高艾草产量和物质含量有利。艾草生物量与光受体基因表达相关性分析表明，光响应转录因子HY5表达量与单株重量呈显著正相关，与地上部分重量呈极显著正相关。HY5是光响应重要的调控因子，红光、远红光、蓝光、UV-A 和 UV-B 均可影响HY5的积累，而且HY5是位于光信号转导的下游调控相关功能基因，还可调控激素相关基因的表达，同时参与生物昼夜节律调控[33]。光响应转录因子调控可能对艾草生物量有重要影响。对艾叶挥发油化合物含量与光受体基因表达量的相关性分析发现，光受体相关基因表达量与挥发油成分之间存在显著相关性。如光受体基因Phot2、CRY1、CRY2、CRY1-1与1,8-桉油素、樟脑呈现负相关，而与龙脑具有正相关。1,8-桉油素、樟脑及龙脑是以牻牛儿基二磷酸盐(Geranyl diphosphate，GPP)为底物，由不同萜类合成酶(Terpenoid synthase, TPS)催化产生的萜类物质。蓝光受体基因表达上调通过抑制 1,8-桉油素、樟脑的合成，促进龙脑积累。综上所述，挥发油合成受不同光处理调控，可通过光受体响应并级联调控相关基因表达。