盐胁迫对药用蒲公英生长特性及有效成分积累与离子吸收分配效应的影响

朱 瑜，谷 巍,2*，邱蓉丽，汤俊杰，刘梦雪，郎培蕾

(1. 南京中医药大学，江苏 南京 210023；2. 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏 南京 210023)

药用蒲公英(Taraxacum officinale)为菊科蒲公英属多年生草本植物，以干燥全草入药，具有清热解毒、消肿散结、利尿通淋等功效，其有效成分主要包括酚酸类，如绿原酸、咖啡酸、菊苣酸等[1]，其中菊苣酸为2020年《中华人民共和国药典》规定的蒲公英药材质控成分[2]。药用蒲公英植株较大、产量高、生长迅速及抗逆性强，已成为中药材市场的主流栽培品，在全国大部分地区均有种植[3]，然而在我国东北、西北以及东部沿海蒲公英主产区存在不同程度的土壤盐渍化问题，为蒲公英生长带来不利影响[4]。研究表明，蒲公英属植物具有一定的耐盐性，但过度盐胁迫会抑制蒲公英生长[5]。

盐渍土通常含有大量 Na+、Cl–、K+、Ca2+、Mg2+、CO32–和 SO42–等，其中 Na+和 Cl–含量最高、毒害最大[6]，不仅形成渗透胁迫，造成离子失衡，还限制植物对其他离子的吸收，造成营养亏缺[7]。此外，Na+毒害促进体内活性氧(ROS)大量积累形成氧化胁迫，破坏植物细胞正常的膜结构[8]，如叶绿体膜结构(叶绿体双层膜解体，类囊体肿胀、排布混乱甚至解体)，影响植物光合同化能力[9]，最终限制植物生长发育。植物可以通过调节阳离子(Na+、K+、Ca2+、Mg2+)的吸收和运输来维持离子稳态，这是植物抵抗逆境的策略[10]。次生代谢调节也是植物应对环境胁迫的适应机制，次生代谢物如酚酸类、黄酮和萜类等非植物正常生长所需物质能作为抗氧化物质[11]、植物抗毒素[12]或信号分子[13]等提高植物抗逆性，而这些次生代谢物通常又是药用植物的主要有效成分，是评价药材品质的重要指标[14]。因此，本文对不同浓度盐胁迫下药用蒲公英生长特性、有效成分积累以及离子吸收分配效应进行研究，以探究药用蒲公英对盐胁迫的响应机制，为药用蒲公英的栽培提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

药用蒲公英取自南京中医药大学药苑，并由南京中医药大学谷巍教授鉴定。

1.2 试验设计

选取大小均匀、饱满的供试药用蒲公英种子，播种于直径25 cm塑料花盆，每盆装3.5 kg干燥园土(风干捣碎，过60目筛)。于人工气候室培养，光/暗周期12 h / 12 h，昼夜温度25/20±2 ℃，光照强度125 µmol·m–2·s–1，相对湿度 60%。当幼苗长至 3～4片真叶时，间苗。培养60 d后进行盐胁迫处理[15]。向盆中喷洒不同浓度NaCl溶液，设置3个NaCl浓度梯度，使土壤NaCl含量分别为0.1%、0.2%、0.4%，以不作任何处理为对照(CK)，每组设置5个重复。托盘中渗出的水及时返盆，防止盐分流失，每 2 d用称重法补充蒸发所损失的水分(约200 mL)。处理24 d后，收集样品进行相关指标测定和电镜观察。

1.3 指标测定

1.3.1 生物量测定

每处理组选取长势一致的药用蒲公英，洗净根部泥土，将地上和地下两部分用电子天平称量鲜重，计算根冠比。于105 ℃杀青15 min后，70 ℃烘干至恒重，称量地上和地下部分干重，两者之和为全株干重。用LI-3000C叶面积仪(美国Li-Cor公司)测量总叶面积，计算叶面积比率(LAR)：叶面积比率=总叶面积(cm2)/植株干重(g)。

1.3.2 叶片相对含水量、叶绿素含量和净光合速率测定

叶片相对含水量(RWC)测定参照Tounsi等[16]的方法；叶绿素含量测定参照李合生[17]的方法；用LI-6400XT便携式光合仪测定净光合速率(Pn)。

1.3.3 叶绿体超微结构观察

在Bejaoui等[18]的方法上稍作修改。将药用蒲公英同一叶位的同一部位(避开主脉)切成 0.5 mm ×3 mm小块，2.5%戊二醛固定，0.1 mol·L–1磷酸缓冲液(pH 7.4)漂洗数次。用1%锇酸室温固定2 h，再经0.1 mol·L–1磷酸缓冲液(pH 7.2)漂洗数次。经 30%～100%乙醇梯度脱水后，环氧树脂渗透包埋。用Leica UC7超薄切片机切片，厚度80 nm。经醋酸双氧铀室温染色，用Tecnai G 20 Twin透射电镜在80.0 kV下拍照观察。

1.3.4 离子含量测定及离子选择性运输能力计算

将药用蒲公英样品根、叶分开，用去离子水冲洗干净后烘干粉碎，过80目筛。称取0.2 g样品粉末，加入6 mL硝酸消解。赶酸至剩余约1 mL，用超纯水定容至50 mL。以6 mL硝酸不加样品为对照。利用电感耦合等离子体质谱仪(NexION350D)测定不同盐胁迫下药用蒲公英根、叶中Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+和 Zn2+含量。

根据袁军伟等[19]的方法计算不同器官对离子运输选择性系数(SX,Na)：SX,Na=库器官[X/Na+]/源器官[X/Na+]，其中X 为K+、Ca2+和Mg2+中任意一种离子，其值越大表示源器官抑制Na+、促进X向库器官运输的能力越强。

1.3.5 菊苣酸含量测定

将药用蒲公英洗净晒干，打粉过 80目筛，按照《中国药典》(2020年)的方法制备供试品溶液[2]。称取菊苣酸对照品12.110 mg，用80%甲醇溶解定容至10 mL，配制成浓度1.211 mg·mL–1菊苣酸对照品溶液。利用Waterse2695高效液相进行含量测定，采用乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)进行梯度洗脱，流速 1 mL·min–1，进样量 10 µL，检测波长328 nm。色谱柱为 C18色谱柱(ZORBAX SB，Agilent)，柱温35 ℃。

1.4 数据处理

采用SPSS25软件的One-way Anova进行差异显著性分析、LSD方法进行多重比较、Spearman相关性分析，采用GraphPad Prism 8软件绘图。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对药用蒲公英生长特性的影响

如图1所示，药用蒲公英叶片和根系的生长随着盐胁迫浓度的升高受到抑制。CK组与0.1% NaCl处理的药用蒲公英叶面积大，叶片鲜绿，且根系发达。0.2%和0.4% NaCl处理的药用蒲公英叶片褪绿发黄，叶缘卷曲干枯，叶面出现褐色枯斑，且根系短小。

图1 盐胁迫下药用蒲公英叶片与根系的形态变化Fig. 1 Morphological changes of leaves and roots of Taraxacum officinale under salt stress

如表1所示，0.1% NaCl处理的植株干重、叶面积比率和根冠比与 CK组无显著差异(p>0.05)，但0.2%和0.4% NaCl处理的干重、叶面积比率均显著下降，根冠比随着盐浓度的升高而升高，叶面积比率显著降低而根冠比显著升高，说明高盐胁迫改变药用蒲公英的生物量分配。Pn随着盐胁迫的加重呈下降趋势，同时药用蒲公英叶片总叶绿素含量随着盐胁迫浓度的升高而显著降低，表明盐胁迫显著降低了药用蒲公英光合能力。叶绿素含量降低也是叶片黄化褪绿的原因。在非盐胁迫下，药用蒲公英叶片相对含水量达 87.07%，叶片鲜嫩柔软。盐胁迫下，叶片相对含水量逐步降低且与 CK组差异显著(p<0.05)，其中0.1% NaCl处理较CK降低7.5%，叶片鲜嫩柔软，而0.2%和0.4% NaCl处理分别较CK降低22.4%和41.9%，叶片厚而干硬发脆。说明在0.2%和0.4% NaCl胁迫下药用蒲公英叶片出现明显的水分亏缺。

表1 盐胁迫下药用蒲公英的生长和生理指标Table 1 Growth and physiological indexes of Taraxacum officinale under salt stress

2.2 盐胁迫对药用蒲公英叶绿体超微结构的影响

由图2可见，CK组药用蒲公英叶绿体呈纺锤形，外膜完整，基质片层排列紧密，基粒片层垛叠整齐有序；0.1% NaCl处理组叶绿体呈纺锤形，外膜完整，基质片层排列较紧密，但在基质片层之间可观察到细微的空隙，基粒片层垛叠整齐有序；0.2%NaCl处理组叶绿体出现肿胀，外膜完整，基质片层间出现较大片空隙，排列混乱，基粒垛叠变少，叶绿体中出现若干大的淀粉粒；0.4% NaCl处理组叶绿体肿胀，外膜部分溶解，基质片层完全紊乱，基粒垛叠全部消失，叶绿体中出现较大淀粉粒。此外，0.4% NaCl处理组还能观察到短粒状和球形线粒体，但部分线粒体外膜破裂，说明高盐胁迫对药用蒲公英叶绿体膜结构造成显著损伤，光合同化产物在叶绿体中积累，向外运输受阻。

图2 不同浓度盐胁迫下药用蒲公英叶绿体超微结构Fig. 2 Ultrastructure of chloroplast of Taraxacum officinale under salt stress

2.3 盐胁迫对药用蒲公英根和叶离子吸收、运输和分配的影响

2.3.1 盐胁迫对根、叶离子含量的影响

图3显示不同浓度盐胁迫下药用蒲公英根和叶中离子含量的变化情况。0.1% NaCl处理组的药用蒲公英叶片Na+含量较低，为1.17 mg·g–1，与 CK组无显著差异；0.2%和0.4% NaCl处理组的叶片Na+含量较 CK 组显著升高，分别达 10.26 mg·g–1和18.03 mg·g–1。盐胁迫未对药用蒲公英根 Na+含量造成显著影响。CK组和0.1% NaCl处理组的根Na+含量显著高于叶Na+含量，0.2%和0.4% NaCl处理组的根 Na+含量显著低于叶。由此可知，低盐胁迫药用蒲公英叶片积累Na+较少，高盐胁迫促进Na+在叶片大量富集，而根Na+含量不受盐胁迫影响。

图3 盐胁迫下药用蒲公英根和叶离子含量的变化Fig. 3 Changes of ion contents in roots and leaves of Taraxacum officinale under salt stress

药用蒲公英根和叶的 K+含量整体表现为叶>根。随着盐浓度升高，叶K+含量呈先升后降的趋势，其中 0.1% NaCl处理组的叶 K+含量显著升高，达51.4 mg·g–1，0.2%和 0.4% NaCl处理组叶 K+含量较0.1% NaCl处理组显著下降。药用蒲公英根、叶的Ca2+和Mg2+含量整体表现为叶>根。叶Ca2+和Mg2+含量随盐浓度升高呈下降趋势。不同浓度盐胁迫并未对根K+、Ca2+和Mg2+含量造成显著影响。

药用蒲公英中各微量元素含量整体表现为：Fe2+>Mn2+>Zn2+>Cu2+。根和叶的 Fe2+含量整体表现为根>叶，随着盐胁迫加剧，根Fe2+含量显著降低，但叶Fe2+含量与CK组无显著差异。根和叶中Mn2+含量整体表现为叶>根，随着盐胁迫加剧，叶 Mn2+含量呈降低趋势，而根Mn2+含量无显著变化。各处理的根Cu2+含量与叶无显著差异，0.4% NaCl处理的根、叶Cu2+含量较其他处理显著下降。各处理Zn2+含量整体表现为叶>根。0.1% NaCl处理根、叶Zn2+含量与CK组无显著差异，0.2%和0.4% NaCl处理的根、叶Zn2+含量显著下降。

2.3.2 盐胁迫下根和叶K+/Na+、Ca2+/Na+和Mg2+/Na+比值的变化

K+/Na+、Ca2+/Na+和 Mg2+/Na+的比值是衡量植物离子平衡破坏程度的指标。如表2所示，不同处理组药用蒲公英根的 K+/Na+、Ca2+/Na+和 Mg2+/Na+比值变化小，差异不显著。0.1% NaCl处理的叶K+/Na+、Ca2+/Na+和Mg2+/Na+比值与CK无显著差异，而0.2%和0.4% NaCl处理的叶K+/Na+、Ca2+/Na+和Mg2+/Na+比值较CK显著下降。

表2 盐胁迫下药用蒲公英根和叶K+/Na+、Ca2+/Na+和Mg2+/Na+比值的变化Table 2 Changes of K+/Na+, Ca2+/Na+ and Mg2+/Na+ ratios of different parts of Taraxacum officinale under salt stress

2.3.3 盐胁迫对离子根至叶选择性运输的影响

离子运输选择性系数反映植物根系对K+、Ca2+和 Mg2+向叶片选择性运输的能力，其值越大说明根向地上部分运输Na+能力越弱，其抗盐性越强[20]。由表3可知，0.1% NaCl处理药用蒲公英根到叶SK,Na、SCa,Na和 SMg,Na升高(P<0.05)，分别为 CK 的1.986、1.246和1.147倍。随着盐胁迫浓度升高，SK,Na、SCa,Na和SMg,Na均显著降低。其中0.2% NaCl处理的 SK,Na、SCa,Na和 SMg,Na分别较 CK 组降低90.0%、89.0%和89.2%；0.4% NaCl处理的SK,Na、SCa,Na和 SMg,Na分别较 CK 降低 92.7%、95.6%和94.1%。说明低盐胁迫明显增强根到叶片K+选择性运输的能力，而高盐胁迫减弱根到叶 K+、Ca2+和Mg2+选择性运输的能力，根向地上部分运输Na+的能力增强。

表3 盐胁迫下药用蒲公英根-叶离子选择性运输的变化Table 3 The changes of ion selective transport from root to shoot of Taraxacum officinale under salt stress

2.4 药用蒲公英生长特性与Na+含量的相关性分析

由表4可知，叶片生理指标(叶面积比率、净光合速率、总叶绿素含量和叶片相对含水量)之间呈现极显著正相关(P<0.001)。叶片 Na+含量与叶片生理指标呈极显著负相关，与根冠比呈极显著正相关。根 Na+含量与生长特性指标间无显著相关。说明叶片Na+含量与叶片生长状态紧密相关。

表4 药用蒲公英生长特性与Na+含量的相关性分析Table 4 Correlation analysis of growth characteristics and Na+ content of Taraxacum officinale

2.5 盐胁迫对药用蒲公英菊苣酸含量的影响

菊苣酸含量为药用蒲公英的质控成分，各处理药用蒲公英的菊苣酸色谱检测如图4。不同浓度盐胁迫下药用蒲公英菊苣酸含量有不同程度变化，0.1% NaCl处理组菊苣酸含量与CK无显著差异，0.2%和0.4% NaCl处理的菊苣酸含量显著降低，分别为CK的65.4%和52.6%，说明高盐胁迫降低了药用蒲公英有效成分菊苣酸的积累(图5)。

图4 标准品及样品色谱图Fig. 4 Chromatogram of standard and samples

图5 盐胁迫对药用蒲公英菊苣酸含量的影响Fig. 5 Effects of salt stress on the content of cichoric acid of Taraxacum officinale

3 结论与讨论

盐胁迫是限制植物生长发育的主要环境因子之一[21]。不同植物或植物不同器官的盐敏感性不同使得植物生物量的分配在盐胁迫下发生变化[22—23]。本实验中，高盐胁迫显著提高药用蒲公英根冠比，表明提高根冠比是植物应对盐胁迫的方式之一[23]，另一方面高盐胁迫降低叶面积比率，表明高盐胁迫下单位生物量的叶面积减小，限制叶片对光能的利用[24]。盐胁迫对植物的危害包括早期渗透胁迫和缓慢积累Na+形成的离子胁迫[25]。本研究中，叶片Na+含量与叶片生理指标显著相关。低盐胁迫下根和叶Na+含量较低，虽未对药用蒲公英的生物量造成显著影响，但叶片相对含水量降低，表明低盐胁迫对药用蒲公英形成一定的渗透胁迫；而高盐胁迫下叶片Na+大量积累，叶片相对含水量大幅降低，表明高盐胁迫对药用蒲公英造成渗透胁迫和离子胁迫。在高盐胁迫下，药用蒲公英叶片黄化褪绿，净光合速率显著下降，从光合系统的角度分析，一方面盐胁迫降低叶绿素含量导致参与光能吸收传递与转化的叶绿素分子减少；另一方面，由于 Na+大量积累导致离子稳态失衡产生大量活性氧形成氧化胁迫，对叶绿体膜结构造成损伤——类囊体基粒和基质片层排列紊乱甚至解体[26]。此外，在高盐胁迫下叶绿体中大型淀粉粒的沉积，可能是由于光合能力下降，使得光合产物以淀粉的形式积累并抑制淀粉向外运输[27]。综上，药用蒲公英叶片 Na+过度积累，对叶片生长发育有抑制作用，是叶片形态出现受害症状的原因。

离子吸收分配的改变是植物对盐胁迫的响应。盐胁迫下大量 Na+内流经非选择性阳离子通道进入细胞，导致静息电位以下的膜电位去极化，从而激活K+外流通道促进K+排出[28]，同时Na+通过竞争性结合K+在细胞质代谢中吸收位点及活性位点，阻碍植株对 K+的吸收[29]。因此，增强 K+吸收维持较高的K+/Na+是植物适应盐胁迫的重要机制。本实验低盐胁迫对药用蒲公英造成渗透胁迫，叶片K+含量升高以及根向叶片 K+选择性运输能力(SK,Na)的增强，有助于调节渗透势，缓解渗透胁迫[30]。而高盐胁迫下由于 Na+大量富集打破叶片中K+/Na+平衡，抑制K+吸收，根向叶片 K+选择性运输能力(SK,Na)减弱，导致盐害加重。根中K+和Na+含量以及K+/Na+不受盐胁迫影响，说明药用蒲公英根的离子平衡较稳定。

Ca2+是植物细胞膜的构成成分，起着维持细胞膜结构和功能的作用。Mg2+是植物生长必需的营养元素，也是合成叶绿素分子组分之一。研究表明，Na+对 Ca2+和 Mg2+的吸收有拮抗作用，这是由于高浓度Na+置换细胞膜中Ca2+和Mg2+，且Na+浓度增加降低Ca2+和Mg2+离子活度，导致植物Ca2+和Mg2+含量降低[31]。本研究中，低盐胁迫下药用蒲公英叶片能维持较高的Ca2+/Na+和Mg2+/Na+；而高盐胁迫下叶片 Na+含量增幅明显高于 Ca+和 Mg2+的降幅，说明 Ca2+/Na+和 Mg2+/Na+比值下降主要是 Na+大量增加造成的。Na+富集抑制叶片对 Ca2+和 Mg2+的吸收，破坏离子平衡，此外Mg2+亏缺还影响叶绿素合成。相反，药用蒲公英根Ca2+/Na+和Mg2+/Na+不受盐胁迫影响，说明根部离子平衡稳定，保证了根部正常生理活动。

Fe2+、Mn2+、Cu2+和Zn2+为植物生长所需的微量元素，参与多种生命活动。不同浓度盐胁迫下植物对不同微量元素的吸收分配方式各异[32—33]。本研究中，Fe2+在药用蒲公英根中分布较多，且Fe2+含量随盐浓度升高而降低。研究表明，Fe是氮还原性同化途径中一系列还原酶的金属辅因子[34]，盐分通过抑制植物铁载体的释放而降低植物从土壤中获取 Fe2+的能力[35]，推测盐胁迫可能抑制药用蒲公英根系对Fe2+的吸收，根部固氮能力下降，导致植物生物量降低。Mn在叶绿体PSII供体侧区域形成锰簇，参与光合放氧[36]，本研究中叶片Mn2+含量随盐浓度升高而下降，说明Mn亏缺可能抑制药用蒲公英光合作用中光反应的光合放氧，导致其光合能力下降。Cu和Zn是Cu/Zn SOD的金属辅基，负责清除光合电子传递过程中形成的超氧化物和生理代谢产生的活性氧[37]。植物锌指蛋白是一类庞大的转录因子家族，在植物生长发育、逆境胁迫应答以及信号转导中发挥重要的调控作用[38]。本研究中，0.2%和0.4% NaCl处理的药用蒲公英根、叶 Zn2+含量大幅下降，Cu2+含量在0.4% NaCl处理下显著下降，表明高盐胁迫下微量矿质元素的减少可能是影响药用蒲公英生长代谢的原因之一。

菊苣酸是药用蒲公英的次生代谢产物之一，其合成和积累与生长环境密切相关。一般过度盐胁迫降低植物次生代谢产物的含量[39]。本研究中，低盐胁迫下药用蒲公英菊苣酸含量与CK组无显著差异，但高盐胁迫下菊苣酸含量显著下降，说明0.2% NaCl以上浓度的盐胁迫超出药用蒲公英承受范围，导致植株次生代谢紊乱，菊苣酸含量降低。

综上所述，药用蒲公英生长和有效成分积累受低盐胁迫(0.1% NaCl)影响较小，植物通过维持较高的 K+/Na+和 Ca2+/Na+，增加 SK,Na、SCa,Na和 SMg,Na保证K+、Mg2+和Ca2+的向上运输，提高耐盐性。高盐胁迫(≥0.2% NaCl)下，由于大量Na+在地上部分积累，导致离子失衡，形成离子毒害，破坏叶片正常的生理代谢和叶绿体超微结构，药用蒲公英的生长及有效成分积累均受到抑制。