靛玉红可减轻骨关节炎大鼠的软骨细胞炎症和损伤

骨关节炎（OA）是一种常见慢性关节退行性疾病，病理改变以关节软骨退变、损伤为特征。随着年龄的增长，骨关节炎的患病率升高，严重影响中老年患者的生命健康及生活质量。软骨细胞炎症和细胞基质丢失一直被认为是导致加重骨关节炎进程的重要病因之一。新的有效的骨关节炎治疗方法对医疗卫生健康系统具有重要意义，多项研究表明多种中药有效成分对骨关节炎的治疗起积极作用，如黄芪甲苷、槲皮素、牛膝皂苷及龙胆苦苷等。

中药青黛的提取物之一靛玉红是一种双吲哚类药物，有抗癌作用，临床用于治疗慢性粒细胞白血病。靛玉红在许多慢性疾病的治疗中起着重要的作用，并表现出强烈的抗炎活性。靛玉红通过NF-κB 和MAPK信号通路抑制脂多糖诱导的小鼠乳腺上皮细胞炎症。另外，靛玉红还可抑制延迟型超敏反应的炎症反应。然而，截至目前，还没有靛玉红对大鼠骨关节炎软骨细胞炎症及损伤作用的相关报道。本文首次探究靛玉红是否对大鼠骨关节炎软骨细胞炎症和损伤具有保护作用。神经细胞PAS结构域蛋白2（NPAS2）是核心生物节律基因中的一个重要成员，它参与调控包括DNA损伤修复、炎症反应、激素分泌等过程。有文献表明NPAS2表达量上调有利于减缓创伤后骨关节炎的进程。NPAS2对大鼠骨关节炎软骨细胞炎症及损伤的作用研究极为有限。吲哚类激素褪黑素可促进纹状体神经元中NPAS2的表达。我们假设靛玉红（吲哚类）通过调节NPAS2表达来减少大鼠骨关节炎软骨细胞的损伤。目前为止，还没有研究表明靛玉红是否可通过NPAS2调控骨关节炎软骨细胞损伤。因此，本文通过IL-1β构建骨关节炎体外细胞模型和建立骨关节炎小鼠模型，首次探究靛玉红对骨关节炎症引起的细胞损伤的作用及机制。

朱熹曾说过：“无一事而不学，无一时而不学，无一处而不学。”终身学习是每一个人基本生存素质，“严谨笃学，与时俱进。”是新世纪教师应有的终身学习观。数学是一门不断在前进与发展的科学，教师只有树立终身学习观念，不断地学习与进步，才能提高自身的数学和数学史素养，并能更好地在数学课堂中，潜移默化地让学生理解、领悟数学史并合理利用数学史，从而发挥数学史真正的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

靛玉红（北京索莱宝科技有限公司）；ACAN兔单抗、COL2A1兔单抗、MMP-13单抗、caspase-3兔单抗、BAX兔单抗、Bcl-2兔单抗、NPAS2兔单抗和GAPDH兔多抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（Abcam）；BCA 试剂盒（Pierce）；Annexin-V FITC/PI 试剂盒（PharMingen）；ThermoScript RT-PCR 试剂盒（Invitrogen）；siRNA（吉玛制药）；MTT试剂盒（Sigma）；引物（北京擎科生物）。

双肺上叶可出现多发的片絮状、斑块状等影像，其余肺叶、肺段出现不同形态的播散灶，可出现斑片状、结节状、索条状等影像表现。

1.2 主要仪器

CO培养箱（Heraeus）；SW-CJ-1FD型超净工作台（苏州安泰空气技术）；BX51光学显微镜（Olympus）；StepOne型qRT-PCR仪(ABI)；凝胶成像系统(上海复日科技)；电泳仪（北京六一生物科技）。

1.3 细胞培养和模型构建

模型构建方法参照文献［21］。于超净工作台内取正常大鼠双侧膝关节软骨，采用含青链霉素双抗的PBS液清洗，离心后弃去上清，用含20%胎牛血清的DMEM-F12培养基于37 ℃、含5%CO培养箱中进行培养。将正常软骨细胞分为以下几组：control组（正常培养的软骨细胞），IL-1β组（10 ng/L IL-1β处理软骨细胞24 h），IL-1β+0.1、0.5、1、2 μmol/L（0.1、0.5、1、2 μmol/L靛玉红分别与10 ng/L IL-1β共同作用大鼠软骨细胞24 h），IL-1β+靛玉红+NPAS2 si（转染NPAS2 siRNA后0.5 μmol/L靛玉红与10 ng/L IL-1β共同作用大鼠软骨细胞24 h），IL-1β+靛玉红+NC si（转染non-specific siRNA后0.5 μmol/L靛玉红与10 ng/L IL-1β共同作用大鼠软骨细胞24 h）

1.4 动物模型构建及分组

收集细胞（每组设置3个复孔），按照试剂盒（BD ApoAlert caspase-3 Fluorescent Assay Kit）说明书检测caspase-3活性，最后记录结果。

1.5 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测NPAS2、ACAN、COL2A1 和MMP-13的mRNA表达

收集各组细胞，Trizol法提取各组细胞总RNA，使用ThermoScript RT-PCR 试剂盒对总RNA 进行反转录，按照荧光定量试剂盒SYBR Premix ExTaq 说明书配置反应体系，每组设置3个复孔。利用2法分析NPAS2、ACAN、COL2A1 和MMP-13 mRNA 的相对表达水平。各引物请见表1。

1.6 Western blot检测蛋白表达

将细胞接种于96孔板，于37 ℃，5%CO环境下培养12 h，待细胞融合达到80%，按照Turbofect操作说明进行细胞转染实验（每组设置3 个复孔）。将NPAS2 siRNA（0.3 μg）和non-specific siRNA（0.3 μg）分别与0.6 μL Turbofect混匀，而后转染进入于96孔板中培养的细胞，37 ℃，5%CO孵育24 h，然后加入0.5 μmol/L靛玉红与10 ng/L IL-1β共同作用大鼠软骨细胞24 h。

1.7 ELISA 法检测细胞上清液中NO、PGE2 和TNF-α的表达

在离心机中以12 000 r/min 离心20 min，分离并收集清液，按照ELISA 试剂盒说明书进行检测，加样后（每组设置3个复孔），37 ℃温育45 min，洗涤后加入链霉亲和素-HRP混匀，37 ℃反应30 min，洗涤后加显色剂避光显色，用酶标仪检测450 nm处吸光度值，计算各因子含量。

1.8 四甲基噻唑蓝染色法（MTT）检测细胞活力

3) 算例结果显示：青岛市智慧城市建设公众参与水平为较高水平，但与高水平仍有较大差距，说明青岛市智慧城市建设公众参与水平仍有较大的提升空间.为进一步提高青岛市公众参与水平可从两个方面着手，一方面是增强教育培训力度、引进高新技术人才；另一方面是进一步提高政务公开平台信息公布及时率，并拓宽表达需求及反馈的渠道.

1.9 流式细胞术检测细胞凋亡

韩愈是唐代古文运动的领导人，他提倡古文，并以此兴儒道。儒家历来重视师道，汉代学习经书的儒生，特别重视从师受业，因此韩愈大力提倡师道。[3]其学生李蟠学道好文，不随俗流，从师于他，于是韩愈作《师说》赠予他。这足以见得韩愈对传道的重视，对师道的推崇。当时士大夫之族都耻学于师，并且嘲笑、打击重视从师的人。韩愈的好友柳宗元曾经这样描写这一现象：“今之世不闻有师，……独韩愈奋不顾流俗，犯笑侮，收召后学，作《师说》，因抗颜而为师。”[1]297

1.10 Capspase-3活性检测

45只SPF级雄性C57BL/6小鼠，鼠龄10周龄左右，体质量25～28 g，购自北京市昌扬西山养殖场，动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010。小鼠适应性饲养1 周后，使用半月板损伤术建立骨关节炎小鼠模型，腹腔内注射35 mg/kg戊巴比妥钠麻醉小鼠，剃除右膝膝关节部位毛并消毒后，切开关节囊，用眼科手术剪刀剪断内侧半月板胫韧带，缝合并消毒，半月板损伤手术结束后，所有小鼠在笼内自由活动和饮食。Sham组小鼠仅切开关节囊。造模4周后，通过小鼠国际骨关节炎研究协会评分筛选出造模成功的小鼠进行药物干预。按照随机数字表法将造模成功的小鼠分为3组，分别为Sham组、OA组、靛玉红组，每组15只。药物干预于造模后3 d开始，靛玉红组小鼠每3 d关节腔注射5 g/kg靛玉红，持续四周；OA组每3 d关节腔注射等量生理盐水。给药结束后采用麻醉断颈法处死小鼠。所有涉及小鼠的实验均经河南省中医院实验伦理委员会批准，伦理编号（PZHNSZYY-2019-023）。

各组细胞按照实验分组进行干预后（每组设置3个复孔），收集各组细胞，PBS洗涤细胞后，采用适量结合缓冲液调整细胞密度的1×10/mL的单细胞悬液。用15 μL Annexin-V FITC（1.5 μL/mL）4 ℃孵育预冷的细胞30 min，PBS清洗细胞3次，6 μL PI孵育9 min，立即采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.11 NPAS2 siRNA转染软骨细胞

小鼠给药结束后麻醉断头处死，取膝关节组织使用液氮研磨法制作组织匀浆。利用RIPA裂解液提取组织匀浆和各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度。取30 μg蛋白样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后（每组设置3 个复孔），转到聚偏氟乙烯（PVDF）膜。用5%脱脂奶粉室温条件下慢摇床封闭PVDF膜2 h。洗膜后，加入一抗4 ℃孵育过夜，洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h，洗膜后加入发光液（ECL），采用凝胶成像分析仪显影曝光，Image Lab软件对蛋白灰度值进行分析。

1.12 统计学分析

采用SPSS 22.0 统计软件（SPSS Inc.Chicago,IL,USA,2011）进行统计学分析，符合正态分布的计量资料使用均数±标准差表示。两独立样本检验，多个独立样本单因素方差分析后进行Bonferroni检测。＜0.05表示差异有统计学意义。分析使用双侧检验。

2 结果

2.1 靛玉红对IL-1β诱导的大鼠软骨细胞增殖能力的影响

Western blot 和RT-qPCR 检测结果显示，IL-1β组软骨细胞中NPAS2 的蛋白和mRNA 表达水平较control组显著降低。IL-1β+0.5 μmol/L组软骨细胞中NPAS2 的蛋白和mRNA 表达水平较IL-1β组则显著升高（图5）。

2.2 靛玉红抑制IL-1β诱导的大鼠软骨细胞的凋亡

与control组相比，IL-1β组软骨细胞凋亡、caspase-3活性和BAX蛋白表达量均显著升高，Bcl-2蛋白表达量显著下降；与IL-1β组相比，IL-1β+0.1 μmol/L组软骨细胞凋亡、caspase-3活性、Bcl-2和BAX蛋白表达量无显著变化，而IL-1β+0.5 μmol/L组、IL-1β+1 μmol/L组和IL-1β+2 μmol/L 组软骨细胞凋亡、caspase-3 活性和BAX蛋白表达量显著降低，Bcl-2蛋白表达量显著升高（＜0.05，图2）。

大多数结直肠癌患者及其家属均对结直肠癌的相关知识知之甚少,在发病之后常常会有焦虑,担忧,心烦意乱的情绪出现,即使是在术后也常常是夜不能寐,担忧害怕等情绪也极大的影响着患者的心情,使患者心情抑郁,严重者甚至会出现自杀的倾向,对患者的生活质量造成了极大的影响。生活质量原指人们生活的优劣,生活质量的高低体现在了人们的生活水平高低,后生活质量又被引入医学研究领域,主要指个体生理、心理和生活职能等方面的状态评估。在将实验组和对照组进行相关数据的对比分析后,可以了解到在常规的护理之下,对患者进行护理干预,通过健康教育、松弛治疗等方法,可以使患者的生活质量和睡眠质量有明显的提高。

将细胞接种到96孔板（1×10/孔），按照实验分组进行干预后（每组设置3个复孔），每孔加入40 μL浓度为4 mg/mL的MTT溶液，孵育6 h后弃去上清液，而后每孔加入二甲基亚砜（160 μL），振荡10 min至结晶完全溶解，以无细胞空白孔调零后，测定各孔的吸光度值。

2.3 靛玉红减少IL-1β诱导的大鼠软骨细胞外基质的降解

与control 组相比，IL-1β组软骨细胞中ACAN 和COL2A1的蛋白和mRNA表达量显著减少，MMP-13的蛋白和mRNA表达水平则增长近一倍。IL-1β+0.5μmol/L组中ACAN和COL2A1的蛋白和mRNA表达水平较IL-1β组显著升高，MMP-13的蛋白和mRNA表达水平则较IL-1β组显著降低（图3）。

2.4 靛玉红抑制IL-1β诱导的大鼠软骨细胞的炎症反应

ELISA检测结果显示，与control组相比，IL-1β组软骨细胞中炎症因子NO、PGE2 和TNF-α表达水平显著升高。与IL-1β组相比，IL-1β+0.5 μmol/L组NO、PGE2和TNF-α表达水平显著降低。因此，靛玉红可抑制IL-1β诱导的大鼠软骨细胞NO、PGE2 和TNF-α表达水平的升高，减少细胞炎症反应（图4）。

2.5 靛玉红上调IL-1β诱导的大鼠软骨细胞中NPAS2的表达量

与control组相比，IL-1β组软骨细胞增殖能力显著降低；与IL-1β组相比，IL-1β+0.1 μmol/L组软骨细胞增殖能力无显著变化，而IL-1β+0.5 μmol/L 组、IL-1β+1 μmol/L组和IL-1β+2μmol/L组软骨细胞增殖量显著升高（图1，＜0.05）。

近几年，我国城市化水平得到了快速发展，城市中的给排水工程的规模也不断扩大。给排水工程是城市建设过程中一项基础工程，其质量，以及运行效果都会对人们的日常生活产生直接影响。因此，在给排水工程施工期间，要采取合理的措施，工程施工进行控制，从而使给排水工程的质量能够得到显著提高。

2.6 靛玉红可通过NPAS2调节IL-1β诱导的大鼠软骨细胞增殖、凋亡、细胞外基质的降解和炎症反应

与IL-1β+靛玉红+NC si 组相比，IL-1β+靛玉红+NPAS2 si组细胞增殖能力、NPAS2和ACAN蛋白表达水平显著降低；同时，细胞凋亡、MMP-13蛋白表达水平、PGE2和TNF-α表达水平均显著升高。因此，靛玉红可通过促进NPAS2的表达量提高IL-1β诱导的大鼠软骨细胞的增殖能力，降低细胞凋亡、细胞外基质降解和炎症因子的表达（图6）。

2.7 靛玉红对模型小鼠关节组织凋亡相关蛋白和细胞外基质蛋白表达的影响

与Sham组比较，OA组中BAX和MMP-13蛋白表达量显著上升，Bcl-2和ACAN蛋白表达量显著下降；与OA组相比，靛玉红组中BAX和MMP-13蛋白表达量显著下降，Bcl-2和ACAN蛋白表达量显著上升（图7）。

3 讨论

骨关节炎的发生发展与多种因素有关，如年龄、肥胖、职业性过度使用和软骨组织新陈代谢失衡等。软骨细胞是关节软骨中唯一存在的细胞，多项研究表明，软骨细胞的异常代谢、炎症和细胞基质降解在骨关节炎的发生发展中至关重要。IL-1β是一种致炎细胞因子，可诱导软骨细胞凋亡，在骨关节炎病变过程中破坏软骨细胞的代谢平衡，可作为诱导骨关节炎体外模型的炎症因子。本研究显示，IL-1β诱导软骨细胞后，细胞增殖力显著下降，凋亡和细胞炎症加剧，细胞基质降解水平升高。

靛玉红对多种疾病中的炎症反应有抑制作用，如靛玉红通过破坏CCL20/CCR6轴介导的炎症循环来改善银屑病样皮炎。靛玉红还可抑制肺部炎症反应。Jung 等研究显示，靛玉红对神经小胶质细胞分泌细胞炎症因子TNF-α、IL-1、PGE 和产生NO与ROS有抑制作用。目前为止，还不清楚靛玉红对大鼠骨关节炎软骨细胞损伤的作用。本研究发现，与IL-1β组相比，IL-1β+0.1 μmol/L组软骨细胞增殖能力、凋亡、capase-3活性、BAX和Bcl-2蛋白表达量无显著变化，而IL-1β+0.5 μmol/L组、IL-1β+1 μmol/L组和IL-1β+2 μmol/L组软骨细胞增殖量和Bcl-2蛋白表达量显著升高，同时细胞凋亡、capase-3 活性和BAX 蛋白表达量显著降低。另外，与IL-1β组相比，IL-1β+0.5 μmol/L 组ACAN 和COL2A1的表达水平显著升高，MMP-13和炎症因子的表达水平则显著降低。说明，靛玉红可减少IL-1β诱导的大鼠骨关节软骨细胞的损伤。在动物实验中，靛玉红可显著降低模型小鼠关节组织中的细胞凋亡和细胞外基质的降解，说明靛玉红对骨关节具有保护作用。

NPAS2又名MOP4，在人体中广泛表达，参与生物钟的调控，并在细胞生长、分化、凋亡、炎症和肿瘤生长抑制等诸多方面发挥重要作用。Song等研究发现，敲除NPAS2显著抑制急性髓性白血病细胞的增殖作用，同时促进其凋亡。Liu等报道表明，NPAS2可能参与调控软骨细胞外基质的稳态，减缓创伤后骨关节炎的进程。然而，NPAS2是否可调节IL-1β诱导的大鼠骨关节软骨细胞的损伤还不清楚。有文献报道吲哚类激素褪黑素可促进纹状体神经元中NPAS2的表达。我们猜测靛玉红可通过调节NPAS2的表达来减少IL-1β诱导的大鼠骨关节软骨细胞的损伤。本研究显示，与IL-1β组相比，IL-1β+0.5 μmol/L组中NPAS2的mRNA和蛋白表达量显著升高，说明靛玉红可有效上调IL-1β诱导的大鼠骨关节软骨细胞中的NPAS2表达水平。干扰NPAS2表达后，与IL-1β+靛玉红+NC si组相比，IL-1β+靛玉红+NPAS2 si 组细胞增殖能力、NPAS2 和ACAN蛋白表达水平显著降低；同时，细胞凋亡、MMP-13 蛋白表达水平、PGE2 和TNF-α表达水平均显著升高。说明干扰NPAS2可有效消除靛玉红对IL-1β诱导的大鼠骨关节软骨细胞的损伤的保护作用。

退役复学高职生有的在陆军服役，有的在海军服役，有的在空军、武警等部队服役；有的虽然属于同一兵种，但服役岗位不同；有的是普通战士，有的是特种兵。兵种和身份的不同，决定了他们在部队的生活经历有很大差异。从调研结果看，特种兵比其他兵种更具有责任心和积极进取的精神，更乐于无私奉献；在部队担任过领导职务或立过军功的战士，大多数都是党员，复学后更容易成为班级的骨干或核心人物。

综上，我们发现0.5 μmol/L靛玉红具有降低IL-1β诱导的大鼠骨关节软骨细胞的损伤的作用。靛玉红可促进IL-1β诱导的大鼠骨关节软骨细胞中NPAS2的表达量，调节软骨细胞增殖能力、凋亡、炎症反应和细胞外基质降解，靛玉红还可降低模型小鼠骨关节组织细胞凋亡和细胞外基质的降解。本研究为骨关节炎防治提供了潜在靶标和理论基础。