氢气通过Bax/Caspase3凋亡通路减轻大鼠创伤性脑损伤的研究

钱 波，冯 莹，邹卓群

创伤性脑损伤为神经外科常见疾病之一，致伤因素主要包括暴力事件、交通事故[1]。该病具有高致残率和高致死率，可导致运动障碍、神经功能障碍，严重者可丧失生活自理能力，影响其生存质量[2]。创伤性脑损伤一旦发生便不可逆，现临床尚缺乏有效治疗方法[3]。氢能透过亚细胞结构，清除氧自由基，减轻氧化应激损伤，抑制神经细胞凋亡，改善学习记忆能力，减轻炎症损伤[4]。已有研究报道，氢气在创伤性脑损伤中具有保护作用[5]，而关于氢气在创伤性脑损伤中发挥效应的机制研究尚少。B淋巴细胞瘤/白血病-2相关X蛋白(Bax)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)通路是一种与凋亡关系密切的重要通路，能够参与创伤性脑损伤的病情进展[6]。研究显示，氢水注射降低了损伤后脊髓中Caspase3活性[7]。有学者发现，氢水能够下调蛛网膜下腔出血(SAH)后早期脑损伤大鼠脑组织中Bax、Caspase3表达水平，减轻其神经细胞凋亡[8]。基于此，本研究探讨氢气是否通过Bax/Caspase3凋亡通路减轻大鼠创伤性脑损伤。

1 材料与方法

1.1实验动物 雄性SD大鼠56只，36～40月龄，280～320 g，SPF级，购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，生产许可证号：SCXK(沪)2017-0012。本实验经我院实验动物管理伦理委员会批准(IACUC-2021-047)，实验动物的使用和处理遵循3R原则。

1.2实验方法

1.2.1模型制作及分组处理：将56只大鼠随机分为对照组、模型组、氢气+通路激活组、氢气组，每组14只。模型制作方法：大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，麻醉后以俯卧位固定于手术台上，沿大鼠颅骨正中线作一纵切口，暴露右侧顶骨，于矢状缝旁开2 mm位置应用颅骨钻制作一个孔(直径约为5 mm)，使用小锤(致伤力度为20 g)自大鼠上方50 cm高度自由落下，制备创伤性脑损伤大鼠模型，止血并缝合，在此过程中保持其硬脑膜完整[9]。造模成功标准：术后可见大鼠不同程度肢体抽搐，呼吸不规则，四肢平衡协调能力变差，瞳孔异常缩小或者扩大、对光反射明显减弱，睫毛反射及刺痛反应消失，部分大鼠可见口腔或鼻腔出血甚至暂时性昏迷，但各行为异常可在30 min内恢复。对照组大鼠除不进行撞击操作外，其余操作相同。造模结束后，氢气组每天吸入1 h氢气(42% H2-21% O2-37% N2)，共干预7 d；氢气+通路激活组在氢气组基础上应用Bax/Caspase3激活剂干预，将5 μg激活剂加入5 μl人工脑脊液中，通过渗压性微量注射泵(苏州讯飞科学仪器有限公司)脑内注射，在10 min内完成注射，共注射1次[10]。对照组和模型组大鼠以相同方式予等剂量生理盐水。

1.2.2标本制作:7 d后于尾尖采血3 ml，3000 r/min离心15 min，获取血清标本，于冰箱中保存待测。大鼠采血后断头取脑，将脑组织在5%多聚甲醛中固定48 h，取挫伤脑组织(挫伤灶为中心，半径为2 cm，厚度为2 mm)分为2份，脱水，以液氮封存于冰箱中待测，一份用于脑含水率测定，另一份用于其他指标检测。

1.2.3HE染色观察脑组织病理形态:从冰箱中取出相应脑组织标本，制成5 μm厚切片，用HE染色试剂盒染色，脱水，透明，封片，在XSP-2CA光学显微镜下观察脊髓背角病理变化。

1.2.4ELISA检测炎性和氧化应激指标水平：取相应试剂盒在酶标仪上应用ELISA检测白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)水平。

1.2.5神经功能损伤严重程度评分(NSS)和脑含水率：NSS包括运动能力实验、反射实验、协调性实验、警觉性实验，最高分为18分，评分越高提示颅脑损伤越重[11]。干湿比重法检测大鼠脑含水率，从冰箱中取出相应脑组织标本，去除凝血，洗去血迹，滤纸吸干表面水分，应用电子天平(东莞市谱标实验器材科技有限公司)测量其湿重，于烘烤箱烘烤96 h后测量其干重，含水率=(湿重-干重)/湿重×100%[12]。

1.2.6Western blot法检测Bax/Caspase3通路蛋白表达：从冰箱中取出相应脑组织标本，加入蛋白裂解液(预冷)，匀浆机制成匀浆液，然后以3000 r/min，4 ℃条件下离心20 min，取上清液(总蛋白)，将其转移至Ep管中，BCA试剂盒测定总蛋白浓度，行SDS-PAGE电泳，用转膜仪将蛋白转移至PVDF膜上，浸泡在5%脱脂奶粉内封闭2 h(25 ℃)，加入相应一抗，即兔抗Bax单克隆抗体(1∶500)、兔抗Caspase3单克隆抗体(1∶300)、兔抗β-actin单克隆抗体(1∶200)，4 ℃孵育过夜，经TBST漂洗3次后加入HRP标记的羊抗兔二抗(1∶2000)，室温孵育2 h，经TBST漂洗3次后用免疫印迹化学发光试剂(ECLReagent)显色，通过凝胶成像系统对图像进行拍摄，并使用Tanon软件对各组蛋白表达量进行分析。

2 结果

2.1氢气对创伤性脑损伤大鼠NSS和脑含水率的影响 实验过程中模型组死亡3只，氢气+通路激活组和氢气组各死亡1只，对照组无大鼠死亡。模型组NSS和脑含水率高于对照组(P<0.05)；氢气+通路激活组和氢气组NSS和脑含水率低于模型组，且氢气组低于氢气+通路激活组(P<0.05)。见表1。

表1 4组大鼠NSS和脑含水率比较

2.2氢气对创伤性脑损伤大鼠脑组织病理的影响 对照组脑组织结构正常且清晰，细胞排列整齐，呈规则形状，未见出血、肿胀及炎性浸润等。模型组脑组织水肿严重，细胞间隙明显增大，细胞核明显固缩，变性坏死、出血坏死及炎性浸润十分明显。氢气组脑组织病理变化较模型组明显减轻，病灶区和水肿区缩小，变性坏死、出血坏死及炎性浸润减少。氢气+通路激活组对脑组织病理的改善作用较氢气组有所减弱。见图1。

图1 4组大鼠脑组织病理变化(HE×400，箭头为病灶区)1a.对照组；1b.模型组；1c.氢气+通路激活组；1d.氢气组；模型组为创伤性脑损伤大鼠

2.3氢气对创伤性脑损伤大鼠炎性指标的影响 模型组TNF-α和IL-1β水平高于对照组(P<0.05)；氢气+通路激活组和氢气组TNF-α和IL-1β水平低于模型组，且氢气组低于氢气+通路激活组(P<0.05)。见表2。

表2 4组大鼠血清TNF-α和IL-1β水平变化

2.4氢气对创伤性脑损伤大鼠氧化应激的影响 模型组SOD水平低于对照组,MDA水平高于对照组(P<0.05)。氢气+通路激活组和氢气组SOD水平高于模型组,MDA水平低于模型组(P<0.05)；氢气组SOD水平高于氢气+通路激活组，MDA水平低于氢气+通路激活组(P<0.05)。见表3。

表3 4组大鼠血清SOD和MDA水平比较

2.5氢气对创伤性脑损伤大鼠Bax/Caspase3凋亡通路的影响 模型组脑组织Bax和Caspase3蛋白表达量高于对照组(P<0.05)。氢气+通路激活组和氢气组脑组织Bax和Caspase3蛋白表达量低于模型组，且氢气组低于氢气+通路激活组(P<0.05)。见表4、图2。

表4 4组大鼠脑组织Bax/Caspase3凋亡通路相关蛋白表达量比较

图2 4组大鼠脑组织Bax和Caspase3蛋白表达情况

3 讨论

由于目前创伤性脑损伤治疗技术和方法受限，其治疗效果不太理想，致残率和病死率居高不下。氢气近年来逐渐应用于多种临床研究中[13]。氢气具有极强的扩散性，极易穿过细胞膜。研究显示，高压氢气对皮肤鳞状细胞癌有一定治疗效果[14]。另有学者发现，吸入2%氢气能够有效清除自由基，减轻大脑缺血再灌注损伤[15]。有研究报道，氢气具有抗氧化作用，氢水能显著降低血脑屏障的通透性，明显减轻脑水肿，显著缩小脑损伤病灶面积，提高因外伤性脑损伤引发的神经功能障碍，且这些正向效应与脑组织中8异前列腺素F2a(8-iso-PGF2a)、MDA水平下调和SOD、过氧化氢酶(CAT)水平上调有关[16]。本研究发现，氢气能够减轻创伤性脑损伤大鼠脑组织病理损伤，即氢气组脑组织病理变化较模型组明显减轻，病灶区和水肿区缩小，变性坏死、出血坏死及炎性细胞浸润减少，且氢气组NSS、脑含水率较模型组显著降低，提示氢气对大鼠创伤性脑损伤具有一定改善作用。创伤性脑损伤后脑组织内大量炎性细胞浸润，炎性因子大量释放，引起邻近组织的炎症反应，诱发创伤性脑损伤后继发性脑损伤。此外，创伤性脑损伤后因红细胞破裂，自由基释放增多，创伤区出现水肿及细胞凋亡反应，触发机体氧化应激损伤，引起MDA和SOD水平异常变化。本研究中，氢气组TNF-α、IL-1β、MDA水平较模型组显著降低，SOD水平较模型组显著增高，提示氢气能够降低创伤性脑损伤大鼠炎症和氧化应激水平。

细胞凋亡主要通过细胞内线粒体途径和细胞外死亡受体途径实现，2条途径最终均是通过活化凋亡相关蛋白酶Caspase而发挥凋亡效应。Bax为Bcl-2家族中十分重要的促凋亡蛋白分子之一，由6个外显子编码，可在线粒体外膜处形成通道蛋白，促使细胞色素C(Cyt C)进入胞浆内，活化下游的凋亡蛋白Caspase。Caspase3为Caspase家族中的凋亡效应因子之一，可直接诱导细胞凋亡，亦可通过调节其他凋亡因子而诱导细胞凋亡。Bax和Caspase3之间能够相互影响，共同参与并调控细胞凋亡进程[17]。研究显示，头颅打击伤后1 h，病灶皮层下海马区Bax mRNA表达量、Caspase3阳性染色细胞数明显升高，24～48 h达高峰，随后逐渐下调，恢复至正常[18]。有学者发现，Caspase3在创伤性脑损伤后神经细胞凋亡中具有关键性作用[19]。本研究结果提示，Bax、Caspase3蛋白在大鼠创伤性脑损伤后呈高表达趋势。本研究结果发现，氢气+Bax/Caspase3组脑组织Bax、Caspase3蛋白表达量较氢气组明显上调，减弱了氢气对创伤性脑损伤大鼠炎症、氧化应激、脑组织病理损伤的改善作用，提示氢气可能通过抗Bax/Caspase3凋亡通路对大鼠创伤性脑损伤起到改善作用。

综上所述，氢气对大鼠创伤性脑损伤具有一定改善作用，能够减轻炎症反应,降低氧化应激水平，减轻脑组织病理损伤，其机制可能与氢气抗Bax/Caspase3凋亡通路有关，但是否还有其他机制有待进一步研究。