升金湖越冬小白额雁与同域家鸭肠道菌群多样性研究

冯佳慧，龚治忠，许娜，刘刚

（安徽医科大学生命科学学院，合肥 230032）

动物肠道是一个独特的微生态系统，肠道微生物群落极其丰富，主要包括细菌、真菌、病毒和原生动物等在内的多种生物，它们在宿主的生命活动中发挥重要作用，成为维持动物健康的一个重要“器官”，并与宿主构成共生关系的“肠道微生态系统”（Lv，2021）。肠道菌群与宿主的健康密切相关，能够起到促进宿主消化、营养吸收、维生素合成、免疫调节和调节宿主的肠道形态等作用（Bäckhed，2004；Eberl & Boneca，2010；Kau，2011；Stanley，2012；Mcfall-Ngai，2013）。肠道菌群具有高度的可塑性，主要受遗传和环境的影响（Chen，2017）。宿主的遗传差异是肠道内群落组成和结构差异的主要因素，宿主出生时由亲代遗传完整微生物菌群，使亲缘关系较近的物种的肠道菌群更为相似；此外，动物肠道菌群的组成也受到食物资源、环境微生物群落、行为习性等外界因素的影响（Eckburg，2005；Nicholson，2012；Hird，2014；Yang，2016；Zhang，2021）。同域生活的物种可以通过共同觅食、身体接触、饮水和栖息环境达到肠道菌群的交互传播（Groussin，2017；Veelen，2017；Liddicoat，2020）。

鸟类是一些疾病的天然宿主和中间传播媒介，由于具有极强的地理扩散能力和广泛的分布范围，鸟类为人禽共患疾病的传播带来了潜在风险，其携带的细菌、病毒和寄生虫等病原体可以传播给其他动物甚至人类，从而引发一系列疾病。作为人禽共患病的重要宿主及传播媒介，候鸟和家禽在一些流行性疾病的发生和传播中扮演着重要的角色（Dewar，2013；Wilkinson，2017；Dong，2019）。长距离迁徙水鸟更是多种疾病的重要传播载体，近年来，随着人为干扰的加剧和栖息地的丧失，候鸟越冬湖泊湿地生态受到严重干扰，迫使部分越冬种群集中在更小的适宜栖息地中，其种群面临疾病暴发的风险增加（Karmiris，2017）。多种禽源疾病的发生和传播与候鸟迁徙线路上的饲养家禽有着密切的关系，在候鸟越冬地湿地周边，经常出现饲养家禽和候鸟在相同的水域混群觅食的现象，候鸟的取食、饮水和排泄粪便等行为能够污染环境中的水源和土壤等，这些污染物通过各种途径在与之接触的密集型饲养的家禽中暴发；同样，家禽体内的病原体也可以传播给候鸟，这种混群行为增加病原体在家禽、候鸟之间的暴发和传播几率，并形成不断循环的双向传播模式，造成病原体在“候鸟-家禽-候鸟-家禽”的反复传播链（Grond，2014；Gibb，2020；Lycett，2020）。肠道病原体不但可以感染野生鸟类和养殖家禽，而且具有感染哺乳动物和人的能力，对人类的威胁也在不断增加，因此研究迁徙水鸟及同域饲养家禽的肠道菌群具有重要的流行病学和公共卫生意义（Gibb，2020）。

长江中下游地区的升金湖（116.92°～117.25°E，30.25°～30.50°N）及其密切相连的江河共同构成的复合湿地生态系统孕育了丰富的水生生物资源，是水鸟在“东亚-澳大利西亚”迁徙路线上重要的迁徙停歇地和越冬地，支持了全球具有重要意义的数十万只越冬水鸟（Chen，2011；Wang，2015）。升金湖湿地也是安徽省人口较为稠密的地区之一，随着经济发展，湿地资源的利用强度逐步加大，人为扰动不断增强，湿地生态受到严重干扰（Peng，2019）。同时，该地区农业和饲养业占比较大，大量越冬水鸟在食物不足时，不得不迁至湖区周边的农田中觅食，农田又是家禽放养场所，觅食的候鸟经常与放养的家禽发生接触，为候鸟和家禽之间的肠道病原体传播提供了条件，极大增加了疾病的暴发和传播风险，也给人类带来潜在的公共卫生风险，因此，开展人口密集聚集区肠道病原体在迁徙鸟类和家禽之间传播规律的研究显得更为重要和迫切（Risely，2017；Ramey& Reeves，2020）。小白额雁是一种长距离迁徙水鸟和重要的湿地指示物种，隶属于雁形目Anserformes鸭科Anatidae，主要在欧洲、西伯利亚等地的极北部繁殖，在日本、中国和韩国越冬（Zhang.，2011）。本文拟采集升金湖越冬小白额雁和同域家鸭的粪便样品，通过16S rRNA V3-V4区域的高通量测序技术，比较两者肠道菌群的组成、结构和功能，揭示越冬水鸟和同域家禽肠道菌群病原体的传播规律，为预防人禽共患病提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2018年12月在升金湖湿地采集粪便样品。采集前，使用望远镜观察觅食的小白额雁雁群，确定周围没有其他鸟群活动并且选择超过150只雁群采集样品。为了避免采样过程中的样本重复，每个粪便样品间隔5 m以上，去除表面泥土等杂质以避免人为干扰和泥土接触，样品放入50 mL无菌离心管，-20℃保存。散养家鸭的粪便样品采集于浅滩，方法相同。共采集30份：小白额雁和家鸭各15份。

1.2 PCR扩增和高通量测序

选择343F（5’-TACGGRAGGCAGCAG-3’）和798R（5’-AGGGTATCTAATCCT-3’）对肠道细菌16S rRNA V3-V4区进行扩增。PCR扩增为30 μL反应体系：2×Gflex PCR Buffer 15 μL，正、反向引物（20 mmol·L）各0.5 μL，DNA模板50 ng，Tks Gflex DNA Polymerase 0.6 μL，ddHO补齐。PCR扩增反应条件：94℃5 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃20 s，26个循环；72℃5 min。第一次PCR反应的产物用作第二次PCR的模板，第二次PCR扩增体系：2×Gflex PCR Buffer 15 μL，1.25 U·μL的Tks Gflex DNA Polymerase 0.6 μL，adapter I5和adapter I7各1 μL，第一次PCR产物50 ng，添加ddHO至30 μL。第二次PCR反应程序与第一次PCR相同，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，送上海欧易生物医学科技有限公司，利用Illumina Hiseq platform（PE250）测序。

1.3 生物信息学和统计分析

2 结果

2.1 物种鉴定和Alpha多样性分析

利用粪便样品DNA提取试剂盒（MagPure Soil DNA KF Kit）提取越冬小白额雁和同域家鸭的30份粪便样品的总DNA，选择细胞色素氧化酶亚基（）基因的引物（上游引物：5’-TTCTCCACCACAAAGACATTGGCAC-3’，下游引物：5’-ACGTGGGAGATAATTCCAAATCCTG-3’）进 行PCR扩增，扩增产物测序结果通过GenBank数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）进行比对分析，结果显示采集的粪便样品为小白额雁或家鸭。对越冬小白额雁和同域家鸭的30份粪便样品进行测序，共得到1 907 023条有效序列，平均每个样品有62 567条，序列长度在403～413 bp之间。将有效序列基于97%相似度归类为5 879个细菌OTUs，其中，越冬小白额雁肠道菌群的OTU数目是4 919个，同域家鸭肠道菌群的是4 359个，两者共享3 378个（57.5%）。Alpha多样性指数结果表明，Chao 1指数显示小白额雁肠道菌群的丰富度高于同 域 家 鸭，且 具 有 显 著 性 差 异（＜0.05），而Shannon-Wiener指数和Simpson指数显示小白额雁和同域家鸭肠道菌群的多样性无显著差异（＞0.05；图1）。

图1 升金湖越冬小白额雁和同域家鸭肠道菌群多样性指数Fig.1 Diversity indices of gut bacteria from wintering Anser erythropus and sympatric Anas platyrhynchos domesticus in Shengjin Lake

2.2 肠道菌群组成分析

越冬小白额雁和家鸭的30份粪便样品中的菌群共检测出50门71纲764属：门级水平上，优势菌群主要有厚壁菌门Firmicutes（47.32%和54.14%）、拟杆菌门Bacteroidetes（24.66%和15.65%）、变形菌门Proteobacteria（16.90%和19.04%）和放线菌门Actinobacteria（3.97%和2.89%）（图2）；纲级水平上，小白额雁肠道菌群中的拟杆菌门和放线菌门丰度高于家鸭，而家鸭肠道菌群中的厚壁菌门和线菌门相对丰度较高，优势菌群为梭菌纲Clostridia、拟杆菌纲Bacteroidia、γ-变形菌纲Gammaproteobacteria、芽孢杆菌纲Bacilli和α-变形菌纲Alphaproteobacteria等，其中，拟杆菌纲和芽孢杆菌纲在越冬小白额雁和同域家鸭肠道中具有显著性差异（=0.000 2和=0.036）；属级水平上，优势菌群为土孢杆菌属、拟杆菌属、乳杆菌属、罗姆布茨菌属和粪杆菌属等，其中，拟杆菌属、乳杆菌属、罗姆布茨菌属和粪杆菌属具有显著性差异（=0.019、=0.013、=0.000 26和=0.000 012）。

图2 升金湖越冬小白额雁和同域家鸭肠道菌群的组成Fig.2 Composition of gut bacteria in wintering Anser erythropus and sympatric Anas platyrhynchos domesticus in Shengjin Lake

LEfSe分析结果表明，越冬小白额雁肠道菌群中的拟杆菌目Bacteroidales、拟杆菌纲、普雷沃氏菌科Prevotellaceae、毛螺菌科Lachinospiraceae和瘤胃菌科Ruminococcaceae相对丰度较高，而家鸭肠道菌群中的芽孢杆菌目Bacillales、肠杆菌目Enterobacteriales、动球菌科Planococcaceae、梭菌科Clostridiaceae_1、消化链球菌科Peptostreptococcaceae和肠杆菌科Enterobacteriaceae相对丰度较高（图3：A）。PCoA结果显示，样品在两者间呈现不规则分布的状态（图3：B）。

图3 升金湖越冬小白额雁和同域家鸭肠道菌群的LEfSe分析（A）和PCoA分析（B）Fig.3 LEfSe analysis（A）and principal co-ordinates analysis（B）of the gut bacteria from wintering Anser erythropus and sympatric Anas platyrhynchos domesticus in Shengjin Lake

2.3 PICRUSt分析

2个物种肠道菌群的功能预测谱共911个COG通路。越冬小白额雁和同域家鸭的主要功能谱是代谢（37.21%）及遗传信息的传递和表达（24.12%）。代谢包括氨基酸的转运与代谢（8.05%），碳水化合物的转运与代谢（7.65%），能量的生产与转换（5.61%），无机离子的转运与代谢（4.76%），辅酶的转运与代谢（4.02%），脂质的转运与代谢（2.86%），核苷酸的转运与代谢（2.64%）和次生代谢产物的合成、转运与分解代谢（1.63%）。遗传物质的传递和表达包括转录（8.57%），复制、重组与修复（6.41%），翻译、核糖体的结构与生物发生（5.85%）和翻译后修饰与蛋白质转运（3.29%）。

2.4 潜在肠道病原细菌分析

在小白额雁和同域家鸭的肠道菌群中，潜在的致病菌有脆弱拟杆菌、产碱假单胞菌、产气荚膜梭菌、舍氏小螺菌、犬螺杆菌和绿脓杆菌，其中丰富度最高的潜在致病菌种是脆弱拟杆菌。单因素方差分析结果显示，小白额雁和同域家鸭肠道病原菌有显著差异的是脆弱拟杆菌（表1）。

表1 越冬小白额雁和同域家鸭潜在肠道致病细菌Table 1 Potential pathogens in the gut of Anser erythropus and Anas platyrhynchos domesticus

3 讨论

不同物种肠道微生物受宿主遗传背景和栖息环境等多种因素的影响而存在一定的差异性，鸟类复杂的生活史特征使其肠道微生物菌群结构具有高度的多样性（Eckburg，2005；Yang，2016；Zhang，2021）。本研究中，越冬小白额雁和同域家鸭肠道菌群Alpha多样性（除Chao1指数以外）和PCoA分析结果表明，小白额雁和同域家鸭具有相似的肠道菌群群落结构。一方面可能由于小白额雁和家鸭都隶属于鸭科，亲缘关系相近；另一方面食物也可能是影响肠道微生物群落结构的重要因素，升金湖越冬小白额雁主要以苔草spp.、禾本科Poaceae植物和地下块茎为食，生活在该区域的散养家鸭除饲料外，在野外觅食时也采食以上食物（Wang，2012）。此外，随着经济的发展和人类农业活动的增加，人为干扰使越冬小白额雁从原来的湖滩转移到附近的农田觅食，会与散养的家鸭发生密切接触，致使越冬小白额雁和散养家鸭可以通过身体直接接触、饮水和土壤等介质进行交互传播（Karmiris.，2017；Perofsky.，2019；Liddicoat.，2020）。受样本数量和环境微生物数据缺乏的限制，后期仍需要深入研究（Groussin.，2017）。

越冬小白额雁和同域家鸭的优势肠道菌群均为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门，这4种细菌类群也是鸟类肠道的核心菌群（Kohl，2012；David& Taylor，2015；Kohl，2016）；与之前报道的升金湖其他水鸟，如白头鹤、豆雁和白额雁等的优势菌群相同，但这4种优势菌群的丰富度与上述越冬水鸟有所差别（Yang，2016；Dong.，2019）。鸟类肠道中的细菌与宿主的食物消化、能量代谢和免疫调节密切相关。厚壁菌门能够帮助宿主吸收食物中的碳水化合物、多糖和脂肪酸等营养物质（Flint，2008）；变形菌门能够促进能量的积累（Worthmann，2017）；拟杆菌门不仅能降解宿主中的蛋白质和多糖，在体外还能够减少脂多糖引发的炎症（Kim & Milner，2007；Thomas，2011；Wexler&Goodman，2017）；而放线菌能够产生胞外酶和次生代谢物促进宿主的健康（Ventura，2007）。苔草、禾本科植物和地下块茎中的纤维素和多糖是小白额雁和家鸭的主要营养来源，与其他水鸟一样，越冬小白额雁摄取这些高淀粉和高纤维素含量的食物可能导致肠道中厚壁菌门的相对含量升高。越冬小白额雁肠道中较高丰度的变形菌门可能有助于促进能量的代谢和积累，为其越冬提供能量（Lu & Domingo，2008）。小白额雁肠道菌群最丰富的代谢功能类别包括氨基酸代谢、碳水化合物代谢、无机离子代谢、辅酶代谢、脂质代谢和核苷酸代谢，这些代谢可能与小白额雁在越冬期面临的残酷环境密切相关，推测可能与为越冬期小白额雁的觅食、飞翔等行为保证足够的能量有关（Wang，2019）。

候鸟和饲养家禽在疾病的传播中起着重要的作用，长距离迁徙水鸟携带的潜在肠道病原体在疾病的暴发和传播中发挥着重要作用（Viana，2016）。近年来，升金湖湿地周边出现大量散养家禽与越冬候鸟在相同水域或滩涂混群觅食的现象，通过身体接触或空气、水、土壤和食物等媒介相互传播，致使越冬候鸟和饲养家禽携带的病原体存在交互感染的风险，从而形成不断循环的传播模式，造成病原体在“野鸟-家禽-野鸟-家禽”的反复传播链。越冬小白额雁和饲养家鸭肠道微生物群落中含有多种影响健康的潜在病原菌，本研究在小白额雁和家鸭的肠道内共发现6种潜在致病菌，进一步分析表明，除了脆弱拟杆菌外，其余潜在病原菌的多样性差异均无显著性。产气荚膜梭菌隶属于梭菌属，是重要的人兽共患病原体，能够造成气性坏疽和食物中毒；而脆弱拟杆菌也能够分泌脆弱拟杆菌毒素造成结肠炎，产碱假单胞菌可以使宿主出现脓毒性关节炎和滑膜炎（Sears，2001；Dutkiewicz，2016；Ohtani &Shimizu，2016）。感染舍氏小螺菌的宿主可能突然发生高热、寒战；犬螺杆菌感染会引起胃炎、消化道溃疡；绿脓杆菌广泛分布于自然界及正常人皮肤、肠道和呼吸道，是临床上较常见的条件致病菌之一，能够引起继发感染（Foley，1999；Gellatly & Hancock，2013；Herp，2021）。升金湖湿地周边人口稠密，越冬水鸟和家禽携带病原细菌可能对其他动物甚至人类带来潜在致病风险，极大增加了疾病的暴发和传播风险，也给人类带来潜在的公共卫生风险，因此，本研究结果对于疾病防控具有重要意义，后期还需进一步研究越冬小白额雁和同域家鸭肠道菌群及其生活环境间的微生物传播及影响机制。