pyrG基因缺失对黑曲霉中赭曲霉毒素A生物合成的影响

胡朝江，张艺格，张智慧，牛志鹏，吕扬勇，翟焕趁，魏 闪，胡元森

河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001

黑曲霉(Aspergillusniger)被美国食品药品监督管理局认定为一般安全可靠无毒的微生物[1]。黑曲霉作为食品级安全的“微生物细胞工厂”[2]，广泛用于酶制剂[3]、有机酸[4]、同源蛋白[5]等工业生产领域中。但近年来，越来越多的黑曲霉菌株被检测出产生赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)[6-8]。OTA具有较强的肾毒性[9]、肝毒性[10]、神经毒性[11]和免疫毒性[12]，能够致癌、致畸、致突变[13]，国际癌症研究机构和世界卫生组织将其列为2B类致癌物[14]。OTA广泛污染谷物[15]、饲料[16]、咖啡豆[17]、葡萄[18]、酒[19]等农产品及食品，严重威胁食品安全及人类健康，在世界范围内造成巨大经济损失。为防止赭曲霉毒素中毒事件的发生，我国GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》规定玉米等谷物及其制品中OTA不得超过5 μg/kg[20]。

构建高效稳定的遗传转化系统是研究OTA生物合成调控机制的重要基础。目前，乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因pyrG缺陷型表达系统在丝状真菌中已得到广泛研究[21-22]。野生型菌株不能在含5-氟乳清酸(5-FOA)的培养基中生长，而pyrG基因缺失菌株只有在含尿嘧啶核苷的培养基中才能正常生长，因此，pyrG基因缺陷型菌株可通过5-FOA和尿嘧啶核苷筛选，pyrG基因回补菌株可在缺乏尿嘧啶核苷的培养基中筛选[23]。研究表明，pyrG基因在真菌次级代谢中发挥重要作用。黑曲霉菌株中pyrG基因缺失能增强糖酵解通量，并提高柠檬酸盐含量[24]；红曲霉中敲除pyrG基因能够提高洛伐他汀和橘霉素含量[25]。

近年来，黑曲霉产毒已引起食品安全领域学者的高度重视，探寻有效抑制黑曲霉产毒的方法与技术是目前研究的难点，也是亟待解决的技术难题。目前，对于黑曲霉中pyrG基因的研究主要集中在构建pyrG遗传转化系统等方面[26-27]。有关pyrG基因对于黑曲霉中OTA生物合成的影响尚未见报道。

作者构建了黑曲霉pyrG基因缺失菌株及回补菌株，发现该基因缺失后显著降低黑曲霉中OTA含量。将菌株接种在不同浓度尿嘧啶核苷培养基中培养，研究OTA含量降低与尿嘧啶核苷的关系。通过检测pyrG基因缺失菌株及回补菌株中OTA生物合成途径中的基因表达水平，研究pyrG对OTA生物合成途径中基因表达的影响。检测pyrG基因缺失菌株以玉米粒为基质培养过程中OTA含量的变化，进一步证实pyrG基因对黑曲霉中OTA的生物合成有重要影响。本研究初步揭示了黑曲霉中OTA生物合成调控机理，对于制定有效策略精准防控OTA污染具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株及质粒

黑曲霉 CBS 513.88野生型菌株(WT)由华南理工大学潘力教授惠赠；E.coliDH5α、pMD20-T载体：日本 Takara 公司；本试验构建的pyrG基因敲除质粒pMD20-pyrG(T1+T2)和回补质粒pMD20-pyrGCom：河南工业大学生物工程学院实验室。

1.1.2 主要试剂

OTA标准品：青岛普瑞邦生物工程有限公司；甲醇(一级色谱纯)：天津市四友精细化学品有限公司；PEG 4000：北京普博欣公司；DNA分子量标准Marker(250～10 000 bp)、氨苄青霉素钠：生工生物工程(上海)股份有限公司；尿嘧啶核苷：广州康龙生物公司；潮霉素B：美国Roche公司；产物纯化、质粒提取、PCR反应体系、连接体系(C113-01)试剂盒：南京诺唯赞生物科技股份有限公司；玉米：本地农产品市场。

1.1.3 培养基

LB培养基、高渗CD培养基、CD培养基的制备参考文献[28]。

PDA培养基：新鲜马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉20 g/L。

DPY培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，磷酸二氢钾5 g/L，硫酸镁0.5 g/L。

YEA培养基：酵母粉20 g/L，阿拉伯糖60 g/L，琼脂粉20 g/L，pH 5.8。

1.2 仪器与设备

1260Ⅱ高效液相色谱仪及C18色谱柱：美国Agilent公司；SHP-150恒温培养箱：上海精宏实验设备公司；E200光学显微镜：南京尼康江南光学仪器有限公司；Mastercycler nexus PCR仪：Eppendorf中国有限公司。

1.3 方法

1.3.1 质粒和同源片段的构建

采用同源重组的方法构建pyrG缺失菌株(ΔpyrG)：参考NCBI公布的黑曲霉CBS 513.88中pyrG基因序列，提取黑曲霉 CBS 513.88基因组，分别通过pyrG-T1-F/pyrG-T1-R及pyrG-T2-F/pyrG-T2-R引物扩增pyrG基因同源臂，分别命名为pyrG-T1及pyrG-T2；纯化后通过试剂盒C113-01连接至载体pMD20上，大肠转化得到质粒pMD20-pyrG(T1+T2)，用引物pyrG-T1-F/pyrG-T2-R大量扩增pyrG同源臂T1与T2融合片段。

pyrG回补菌株(pyrGCom)的构建：分别用pyrGCom-pyrG-F/R和pyrGCom-hygB-F/R引物扩增构巢曲霉pyrG基因和潮霉素抗性基因hygB表达框，并连接至载体pMD20上，大肠转化构建pyrG基因回补质粒pMD20-pyrGCom。本研究所使用的引物如表1所示。

表1 本研究所用引物

1.3.2 转化子的筛选

将pyrG基因的同源臂融合片段通过PEG介导法转入野生型菌株，通过在高渗CD培养基中添加5-FOA和尿嘧啶核苷初步筛选营养缺陷型菌株，将转化子依次接种在含有5-FOA和尿嘧啶核苷的CD及PDA培养基中进行传代培养，进一步筛选pyrG缺失菌株。通过添加潮霉素B的高渗CD培养基初筛pyrG回补菌株转化子，并进行传代验证。分别将转化子接种入DPY培养基中，培养2 d，待其长出菌丝后提取基因组进行PCR验证。正确的转化子分别为pyrG基因营养缺陷型菌株和pyrG基因回补菌株。

1.3.3 黑曲霉菌株菌落形态、直径及孢子量测定

将黑曲霉孢子液接种于PDA培养基中，于30 ℃培养6 d，加入适量无菌水，收集黑曲霉孢子，通过无菌医用纱布过滤菌丝，用血球计数板计数，将孢子悬液调整为1.0×106cfu/mL备用。将5 μL孢子液接种于YEA培养基上，于30 ℃静置培养6 d，记录菌落直径[29]及形态。用血球计数法测定孢子量，每组3个平行。

1.3.4 OTA含量的测定

将200 μL浓度为1.0×106cfu/mL孢子液接种于YEA培养基上，于23 ℃避光静置培养6 d。取平板上的菌丝称质量，将菌丝及琼脂放入锥形瓶中捣碎，加入适量(20～25 mL)甲醇，室温下150 r/min避光振荡1 h，用0.22 μm滤器过滤取上清液，每组3个平行。通过高效液相色谱-荧光检测器(HPLC-FLD)检测[30]OTA含量。流动相为乙腈-水-冰乙酸(体积比为99∶99∶2)，流速为1 mL/min，进样量为20 μL，柱温为30 ℃，激发波长为330 nm，发射波长为460 nm。将OTA标准品梯度稀释后依据液相色谱检测条件进行检测，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

OTA含量=CV/m，

式中：C为质量浓度,μg/mL；V为甲醇体积，mL；m为菌丝质量，g。

1.3.5 尿嘧啶核苷的浓度对黑曲霉pyrG基因缺失菌株产OTA的影响

将200 μL孢子液接种于含不同浓度(10、20、50、100 mmol/L)尿嘧啶核苷的YEA培养基中，于23 ℃黑暗条件下培养6 d，按照1.3.4的方法检测OTA含量，结果取3个平行试验的均值。

1.3.6 荧光定量PCR

按照文献[31]的方法提取总RNA，反转录参照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行；内参引物为gpdA[31]；数据经过StepOne Software v2.3软件分析后得出相关基因的表达情况，利用2-ΔΔCt法计算不同样品中各个基因的相对表达量，通过t-检验进行显著性分析，每组3个平行。

1.3.7 黑曲霉pyrG基因缺失菌株在玉米中的产毒分析

称取大小均一、形态相似的玉米粒15 g，在次氯酸钠溶液(1%)中浸泡1 min，无菌水洗净后备用[32]。将玉米粒放入三角瓶中，加入浓度为1.0×106cfu/mL的孢子悬液，室温下振荡1 h，将其转移至平板中，于23 ℃下避光静置培养6 d，按照1.3.4的方法检测OTA含量，每组3个平行。

2 结果与分析

2.1 黑曲霉pyrG基因缺失及回补菌株构建

pyrG基因缺失菌株构建如图1所示。提取pyrG基因缺失菌株基因组，以引物YZ-pyrG-F/R进行PCR扩增验证转化子。结果显示，由于pyrG基因缺失导致突变株的扩增片段变小(图2泳道3)，表明已成功构建pyrG基因缺失菌株。选取正确的转化子进行多次传代培养，证明其遗传性状稳定。

将回补质粒pMD20-pyrGCom导入黑曲霉野生型中，筛选获得阳性转化子，提取基因组，用引物YZ-pyrGCom-F/R进行PCR扩增验证转化子，结果显示，转化子条带大小与预期相符(图3泳道3)，表明pyrG回补菌株构建成功。

2.2 pyrG基因缺失对黑曲霉生长、产孢及OTA生物合成的影响

pyrG基因缺失或低表达能够抑制黑曲霉菌株的生长[24]。在YEA培养基中30 ℃培养6 d后，pyrG基因缺失菌株菌落直径与野生型菌株和pyrG基因回补菌株相比明显降低，且存在显著性差异(图4)，与文献[24]报道的一致。此外，pyrG基因缺失后，分生孢子数目也明显低于野生型菌株及回补菌株(表2)。

目前，丝状真菌中关于pyrG基因的研究主要集中于构建pyrG遗传转化系统[33-34]及影响菌株柠檬酸盐[24]、洛伐他汀和橘霉素合成量[25]等方面，尚无关于pyrG基因影响OTA生物合成的研究报道。为了检测pyrG基因缺失对黑曲霉中OTA含量的影响，将黑曲霉pyrG基因缺失菌株、pyrG基因回补菌株及野生型菌株分别在23 ℃下避光培养6 d，检测OTA含量的差异。结果显示，pyrG基因缺失菌株OTA含量为8.2 μg/g，与野生型菌株及回补菌株相比，分别下降了77.8%和75.7%(表2)。结果表明pyrG基因缺失影响黑曲霉中OTA合成。

表2 pyrG基因对黑曲霉生长及产毒的影响

2.3 尿嘧啶核苷的浓度对黑曲霉pyrG基因缺失菌株产OTA的影响

研究表明，尿嘧啶核苷浓度影响丝状真菌次生代谢物合成。添加高剂量的尿嘧啶核苷能够提高红曲霉pyrG基因缺失突变菌株代谢产生洛伐他汀和橘霉素的能力[25]。黑曲霉pyrG基因缺失获得尿嘧啶核苷营养缺陷型菌株，其影响OTA生物合成可能与尿嘧啶核苷的含量有关。为了验证该推测，在pyrG基因缺失菌株中添加不同浓度(10、20、50、100 mmol/L)的尿嘧啶核苷。结果显示，添加不同浓度的尿嘧啶核苷并没有显著影响OTA毒素的合成，毒素含量分别为8.2、7.9、8.0、8.3 μg/g(图5)。与推测相反，表明pyrG基因对不同次级代谢产物的影响不同，pyrG基因缺失影响OTA合成与尿嘧啶核苷剂量无关。

2.4 pyrG基因缺失及回补对OTA合成关联基因表达的影响

目前，OTA生物合成途径已得到深入研究[35]。通过比较基因组学[36]及全基因组序列[37]，证实OTA生物合成途径中的基因以基因簇形式存在，包含4个高度保守的基因pks、p450、nrps、hal，分别编码聚酮合酶(PKS)、单加氧酶(P450)、非核糖体多肽合成酶(NRPS)、氯化酶(HAL)，以及一个bZIP转录因子。通过荧光定量PCR技术，检测pyrG基因敲除菌株OTA生物合成基因簇内基因转录水平的变化。结果显示：与野生型菌株相比，pyrG基因缺失菌株中pks、p450、nrps、hal及bZIP基因的表达水平分别下调52.0%、36.0%、84.0%、46.0%、74.0%；与回补菌株相比，以上基因分别下调55.7%、42.1%、85.1%、50.3%、76.0%。结果表明，pyrG基因缺失影响黑曲霉中OTA合成途径基因pks、p450、nrps、hal及bZIP的表达，从而降低了OTA的合成水平(图6)。

2.5 pyrG基因缺失对玉米中黑曲霉生长及产毒的影响

为了检测pyrG基因缺失对农产品上黑曲霉菌株生长及产毒的影响，将野生型菌株、pyrG基因缺失菌株及回补菌株的等量孢子液分别与玉米混匀，培养6 d后记录生长情况，检测OTA含量。结果表明，与野生型菌株及pyrG基因回补菌株相比，pyrG基因缺失菌株在玉米中生长缓慢(图7)。利用HPLC-FLD对OTA进行测定，结果显示，接种pyrG基因缺失菌株的玉米中检测不到OTA(图8)，结果进一步证实pyrG基因缺失影响黑曲霉生物合成OTA。

3 结论

作者构建了pyrG基因缺失菌株及回补菌株，发现pyrG基因缺失抑制黑曲霉菌株生长及OTA生物合成。此外，在pyrG基因缺失菌株中添加不同浓度尿嘧啶核苷不影响OTA含量，表明pyrG基因对不同次级代谢产物的影响不同，pyrG基因缺失菌株OTA含量的降低与尿嘧啶核苷浓度无关。荧光定量PCR的数据表明，pyrG基因缺失菌株OTA生物合成途径基因簇中pks、p450、nrps、hal、bZIP基因的表达水平均下降，表明pyrG基因缺失通过影响OTA生物合成途径中的基因表达进而影响OTA生物合成。pyrG基因缺失对OTA生物合成的影响进一步在以玉米粒为基质的培养基中得到证实。本研究构建了黑曲霉pyrG遗传转化系统，证实了pyrG基因通过影响OTA生物合成途径相关基因表达从而影响黑曲霉OTA的合成，研究结果丰富了黑曲霉中OTA生物合成调控机理，为制定有效策略精准防控黑曲霉OTA污染提供潜在靶点蛋白。