姜黄素-淀粉纳米微胶囊的研制及其抗氧化研究

王明明，关二旗，李萌萌，卞 科

河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001

具有生物活性的小分子多是疏水性的，难以被人体吸收利用，淀粉纳米粒子具有良好生物相容性和负载效率，作为载体可提高小分子吸收利用率。由于天然淀粉尺寸较大，晶区致密，负载和吸附能力较差，为增加其对小分子的接触概率和吸附能力[1]，可以通过物理(真空冷等离子体处理[2]、超声波处理[3])或化学(酸水解[4]、乳液法[5-6])手段将天然淀粉转化为具有较大比表面积的淀粉纳米颗粒(SNPs)。

国外研究表明姜黄素(Cur)在治疗新冠肺炎中可发挥潜在作用[7]。姜黄素是从姜黄中提取的一种具有代表性的强疏水多酚，以抗氧化、抗炎、抗菌和抗疲劳而闻名。但是姜黄素不溶于水，极大地限制了其应用，而采用生物相容性材料作为载体可大幅度提高姜黄素的稳定性和利用率。袁帅[8]通过电喷雾制备了包裹姜黄素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微胶囊，甘招娣[9]通过米糠清蛋白-壳聚糖自组装了负载姜黄素。

选用支链淀粉含量99%以上的糯玉米淀粉(WCS)，因为每个分支由14～18个葡萄糖组成[10]。用淀粉脱支酶水解后，得到大量的短线性葡聚糖(聚合度<20)，比天然直链淀粉(聚合度≈1 000)更易自发形成左旋螺旋结构，内部生成疏水空腔[11]，为生物活性分子的封装提供了良好的条件。比如Yoon等[12]通过将不同链长的直链淀粉与辅酶Q10结合，发现短直链淀粉可以更好地包埋疏水物质；必需脂肪酸[13]、C10芳香分子[14]、药物分子环丙沙星[15]都可与短直链淀粉复合。Zhao等[16]在超声波和微波的协同作用下，发现莲子淀粉与绿茶多酚能形成V型复合物。Gao等[17]发现槲皮素通过氢键与淀粉结合形成了结晶度较高的复合物。

作者利用超声波技术控制纳米级油包水(W/O)乳液的形成，使脱支后的短直链淀粉在纳米乳滴中回生，通过简单的溶剂交换，实现姜黄素包封。通过动态光散射、X射线衍射、傅里叶变换红外光谱、热重分析和电镜分析，对淀粉纳米粒子-姜黄素微胶囊进行详细表征，并验证了淀粉纳米粒子-姜黄素在体外抗氧化的功能特性。本研究首次使用荧光检测法定位微胶囊体系中被负载姜黄素的位置，并应用到薄膜中作为抗氧化包装。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

糯玉米淀粉(WCS,支链淀粉含量≥99%)：美国Kang Biological Products公司；面包片：市售；普鲁兰酶(≥1 000 NPUN/g)、姜黄素(纯度≥95%)、2，2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH)、分析级大豆油、Span80、异硫氰酸荧光素(FITC)：美国Sigma-Aldrich试剂公司；聚己二酸/对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)：德国巴斯夫公司。

1.2 仪器与设备

Infinity1260凝胶渗透色谱：美国Agilent公司；5810R超速离心机：德国Eppendorf公司；FreeZone6Plus真空冷冻干燥机：美国Labconco公司；SPX550探头式超声波破碎仪：美国Branson Emerson公司；Quanta250扫描电子显微镜：美国FEI公司；HT7700透射电子显微镜：日本Hitachi公司；3000激光粒度仪：英国Mastersizer公司；2010-L干法激光粒度分析仪：中国耐克特公司；449C热重分析仪：德国Netzsch公司；FV3000激光共聚焦扫描显微镜：日本Olympus公司；D8 Advance X射线衍射仪：德国Bruker AXS公司；Tensor II傅里叶变换红外光谱仪：德国Bruker公司；UV-2000紫外-可见分光光度计：美国Unico公司；DS 32双螺杆挤出机：中国赛信公司；XLB 350四柱热压机：上海齐才液压机械有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 糯玉米淀粉酶法脱支

将WCS溶解于pH 5.0磷酸盐缓冲液(3 g/100 mL)中，加热至85 ℃。冷却后，加入4 NPUN/g普鲁兰酶酶解(58 ℃，24 h)。随即沸水浴，离心(5 000g，10 min)除去酶。取上清液，加入2倍体积的无水乙醇，静置30 min，将沉淀真空冻干(-80 ℃，0.01 MPa)得到脱支淀粉(DBS)。

1.3.2 淀粉纳米粒子的制备

参照Dehghan-baniani等[5-6]的方法并略有修改，把脱支淀粉用水溶解至质量分数2%，搅拌均匀，油浴加热(150 ℃，30 min)使脱支淀粉完全糊化(溶液澄清透明)。探头超声处理20 min(50%振幅)使淀粉链完全分散。加入体积比为2∶3的大豆油和Span80(体积分数2%)，采用高速均质器制备粗乳液，超声脉冲处理30 min(振幅50%，开2 s，关1 s)，得到均匀的W/O乳状液。将乳状液置于4 ℃冰箱中冷藏12 h，使微水滴内的脱支淀粉完全回生。对乳液进行3次反复冻融处理以打破稳定的乳液状态，破乳后油水分层，去除油相后用乙醚和水洗涤并离心(8 000g，10 min),冷冻干燥得到淀粉纳米粒子(SNPs)。

1.3.3 脱支淀粉和淀粉纳米粒子的分子量分布

参考Guo等[18]的方法并略有修改。1 mg样品溶解于100 mL 90%二甲基亚砜溶液中。流动相为0.1 mol/L硝酸钠，500 mg/L叠氮化钠水溶液，样品溶液摇匀，过0.22 μm滤膜后进样分析。色谱柱：两根PL aquagel-OH mixed(8 μm)，柱温30 ℃，进样50 μL，分析时间30 min。检测器为RI检测器和激光光散射检测器。采用一系列相对分子质量(420、1 010、1 970、3 860、3 930、7 920、12 140、21 030、21 230、21 300、49 860、66 200、185 000、272 400、1 046 000)的聚乙二醇(PEG)标准品在相同测试条件下得到GPC标准曲线。使用Agilent GPC/SEC软件，利用Mark-Houwink参数[19]计算主要组分的重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)。因组成淀粉分子的脱水葡萄糖单元的分子量为162，则淀粉分子的聚合度(DP)=Mw/162。样品的多分散度(PD)=Mw/Mn，PD反映分子量差别的范围。

1.3.4 淀粉纳米粒子负载姜黄素

将SNPs与水混合(2%，W/V)，超声处理(50%振幅，5 min)，使SNPs完全分散。将Cur溶于无水乙醇(0.2%，W/V)后，将两个溶液混合，在55 ℃下减压蒸馏、旋转蒸发除去乙醇。用乙醇洗去SNPs表面的Cur，离心(12 000g，10 min)后冻干，得到负载姜黄素的淀粉纳米粒子(SNPs-Cur)。组装纳米胶囊原理图(通过3Ds MAX绘制)如图1所示。

1.3.5 扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)

冻干的SNPs粘在导电胶上，表面喷金后用SEM观察。SNPs与无水乙醇混合，形成5%的悬浮液，滴在铜网上，自然干燥，在TEM下观察。

1.3.6 动态光扫描(DLS)

用水稀释SNPs至0.1%，超声处理5 min(振幅50%)，使SNPs完全分散。采用动态光散射法测量SNPs在液体中的粒径分布。另用干法激光粒度分析仪直接将冻干SNPs加入吸料口中测量粒径。

1.3.7 热重分析(TGA)

在干燥氮气的动态气氛下进行，流速为20 mL/min，温度为25～600 ℃，升温速率为10 ℃/min。

1.3.8 激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)

将冻干后的SNPs-Cur与FITC混合，滴在载玻片上。在激发光波长分别为425 nm和490 nm下观察SNPs-Cur复合物的荧光。

1.3.9 X射线衍射(XRD)

Cu-Kα辐射源(λ=0.154 6 nm)在40 kV和40 mA下工作。样品在3°～50°(2θ)扫描，速率为5.0°/min。

1.3.10 傅里叶变换红外光谱(FT-IR)

KBr粉末在120 ℃中干燥24 h。SNPs、Cur、WCS和SNPs-Cur分别与KBr混匀研磨压片至质量分数2%。累积分辨率4 cm-1，光谱范围400～4 000 cm-1。

1.3.11 姜黄素的负载率及体外抗氧化活性测定

采用紫外-可见分光光度计测定Cur的负载率(LC)。用无水乙醇溶解姜黄素配制母液(0.12%)，分别取母液0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL，定容到10 mL。测定吸光度，得到标准曲线：y=0.051 82x-0.002 91(R2=0.998 19)。将SNPs-Cur加入无水乙醇中，高速振荡60 min，离心(12 000g，10 min)并取上清液测定吸光度。LC=姜黄素的负载量/淀粉纳米粒子的质量。

DPPH自由基清除试验：准确称量4 mg DPPH溶于无水乙醇中，定容到100 mL，将4 mL DPPH溶液与提取液混合均匀。在黑暗中放置30 min，在517 nm处测定溶液的吸光度。提取液分为2组：4 mL DPPH和0.5 mL无水乙醇为对照组；4 mL DPPH和0.5 mL的SNPs-Cur提取液为试验组。

清除率=(A0-A*)/A0×100%,

式中：A0为对照组吸光度;A*为试验组的吸光度。

1.3.12 薄膜成型工艺

添加1%的SNPs-Cur到PBAT粉料中，搅拌均匀，100 ℃烘24 h除去水分。投料到双螺杆挤出机中，温区设置为40、90、130 ℃，螺杆转速为180 r/min。物料挤出后，由热压机压制成厚(0.25±0.02)mm薄膜。

1.3.13 面包片的抗氧化包装储藏

把面包片置于3种包装(聚乙烯膜、PBAT膜、添加1%的SNPs-Cur的PBAT膜)中对比。在RH 80%±5%、25 ℃储藏10 d后取出，检查面包的外观变化。

1.4 数据统计分析

每个试验做3次平行试验。数据处理和绘图采用SPSS 20和Origin 2018。

2 结果与讨论

2.1 DBS和SNPs的分子量分布

由表1和图2可知，DBS样品中的主要成分是短线性葡聚糖，DP为11.64，SNPs的DP为11.90；DBS和SNPs的相对分子质量分布均较窄，且聚合度相似，可以认为淀粉纳米粒子是由单链短线性葡聚糖通过自发形成左旋螺旋而产生的。其他学者也得到相似的结论，如Lu等[20]通过不同体积分数的乙醇沉淀得到DP在6.01～34.57之间的DBS，得出DP在10～16更容易形成结晶，Li等[21]发现从糯玉米淀粉脱支的短链直链淀粉DP比从马铃薯淀粉的低，且更易老化。

表1 DBS和SNPs的分子量分布

2.2 淀粉纳米粒子的微观形貌

2.2.1 形态学分析

SEM图像(图3)显示SNPs呈圆形和椭圆形，粒径为(200±40)nm，这种形态是由于吸附作用相互黏结形成[6]，证明SNPs具有通过表面吸附作用负载药物分子的能力。从TEM图像(图3中A、B、C、D)观察到SNPs的内部有阴影，在电子束聚焦时，SNPs暴露于200～1 000 K和真空状态导致外壳收缩，颗粒尺寸变小，表明SNPs内部不是致密无空隙，而是中空的结构，证明SNPs通过自发形成的螺旋结构产生内部疏水区或间隙为客体小分子提供可容纳的空间，中空结构较之实心结构而言具有更高的负载效率，SNPs有成为疏水性活性小分子的外壳或载体的巨大潜力。

2.2.2 淀粉纳米粒子的粒径分布

由图4可知，在液体环境中，由于超声探头的强烈空化作用，相互黏结的SNPs均匀分散，SNPs粒径分布约为200 nm，这与SEM的结果一致。干式激光粒度分析仪表明，样品的粒径主要分布范围为950～1 350 nm，推测空气中的SNPs聚集效应可能是由静电吸附引起的。

2.3 热稳定性分析

由图5可知，SNPs-Cur第一个质量损失阶段位于130 ℃之前，因为加热使水分蒸发。第二阶段是在200 ℃之后，SNPs晶体结构逐渐碳化被破坏。在200～280 ℃范围内，SNPs-Cur的质量损失率较SNPs慢，因为Cur通过疏水相互作用和氢键被封装在SNPs内部，形成V型结晶结构，SNPs外壳对Cur起到了很好的保护作用，提高了Cur的热稳定性[22]。由于Cur的闪点在209 ℃，随着温度继续升高导致Cur分解。300 ℃后淀粉开始碳化，SNPs-Cur质量逐渐趋于稳定，与Abbas等[23]的结果一样。

2.4 CLSM荧光检测淀粉纳米粒子负载的姜黄素

Cur本身有两个苯环，可以发出浅绿色荧光。在图6A、B中，淀粉处于部分团聚状态，将光源切换到波长为425 nm的激发光后，淀粉内部出现Cur特异性荧光，且荧光强度随着SNPs聚集而增加，这表明Cur存在于SNPs内部而非表面。为了进一步说明Cur与SNPs紧密结合，采用FITC对淀粉进行染色，在490 nm和425 nm处获得了叠加场的照片，由图6C可以看到，在SNPs中出现了Cur的荧光，这是一个有力的证据。

2.5 XRD结晶构型分析

由图7可知，WCS在15°、16.8°、17.9°和23°具有衍射峰，其晶体构型为典型的A型，与Wang等[24]的结果一致。SNPs衍射峰在16.8°、20°、21.7°和23.8°，为B+V型结晶。SNPs-Cur在13°、15°、16.8°、19.7°和22.4°有衍射峰，是V型结晶，与Kong等[25]结论一致，表明形成了淀粉脂质复合物。Cur在天然状态下有多个衍射峰，具有高度结晶结构，当Cur被SNPs包含进去后，在复合物的X射线衍射图中未看到Cur的特征峰，说明Cur以无定形的形式存在于SNPs内部，无定形状态有利于人体吸收和利用。

2.6 淀粉纳米粒子与姜黄素的结合方式

2.7 姜黄素的负载率和DPPH自由基清除能力

SNPs-Cur提取液的吸光度是0.432，代入到标准曲线方程得到母液8.49 mL对应的标准溶液浓度，姜黄素的负载率为75.5 mg/g(P<0.05)。仅使用姜黄素质量浓度为0.5 g/300 mL的乙醇溶液旋转蒸发法制备的SNPs-Cur的DPPH自由基清除率为59.3%(P<0.05)，与100 μmol/L 的白藜芦醇的DPPH自由基清除率相当[30]。

2.8 面包抗氧化包装储藏试验

为避免误差和环境干扰等偶然性因素的影响，在面包储藏过程中每个样品设置2组平行试验，结果如图9所示。经过10 d的贮藏后，聚乙烯包装(a、b)中的面包片出现轻微程度发霉，这和聚乙烯薄膜有较好的阻隔性能有关，环境水分无法通过薄膜迁移。与PBAT薄膜(c、d)和添加SNPs-Cur的PBAT薄膜(e、f)对比，e、f组的面包片的褐变和霉菌的生长受到明显抑制，抑制了孢子的形成，并减少了菌丝的生长。结果表明添加SNPs-Cur的PBAT薄膜具有抗氧化及延缓霉变的能力，可应用于鲜湿面制品或水果等的包装，有效延长食品货架期。

3 结论

通过控制W/O乳液法制备的SNPs可通过包埋作用提高Cur的稳定性和生物利用率。该方法制备的SNPs对疏水物质具有良好的吸附性能。通过简单的溶剂交换获得负载Cur的SNPs，在SNPs-Cur中，短直链淀粉自发形成左旋螺旋结构和疏水空腔，Cur通过疏水相互作用和氢键复合在SNPs内部，呈V形结晶，且热稳定性良好。本研究使用荧光定位法检测到被负载的客体小分子的位置，结果表明短直链淀粉是疏水性生物活性分子的良好载体，对被包埋物质具有很强的保护和负载能力，同时，淀粉本身是一种无毒无害的物质，具有良好的生物亲和力。本研究的方法为合理设计未来的口服给药系统提供了参考，该系统可以克服生理障碍，为细胞提供更好的稳定性和特异性。且SNPs-Cur添加到包装材料中通过简单的面包包装贮藏试验证明可长效缓释姜黄素的抗氧化能力，延长食品货架期。