食品香料4-丙基苯酚对黄曲霉菌的抑制作用研究

张明明，马卫宾,2，王 冲，谢岩黎*

1.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001 2.河南省粮油食品安全检测与控制重点实验室，河南 郑州 450001

黄曲霉菌(Aspergillusflavus)是粮油储藏中常见致病菌之一，能产生毒性极强的次级代谢产物黄曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)，对人和动物的肝脏有致癌、致畸和致突变性[1]，被国际癌症研究机构(IARC)定为Ⅰ类致癌物[2]。黄曲霉菌极易在粮食的播种、收获、运输及储藏过程中污染农作物，尤其是花生、玉米等油料作物[3]，不仅会造成巨大经济损失，还能通过黄曲霉毒素在食物链中积累引起严重的食品安全问题，最终危害人类健康[4]。我国作为粮食生产和消费大国，致力于寻找安全高效的方法控制黄曲霉菌污染，以保障粮食安全和食品安全[5]。

目前普遍使用人工合成杀菌剂控制产毒真菌，但由于其降解时间长、有毒物残留和对人类健康有潜在影响，因此国内外研究者开始致力于从天然化合物中寻找安全、高效、经济且环境友好的新型抑菌物质替代传统防腐剂。目前已鉴定出多种天然抑菌物质，主要存在于植物香料中，一些植物精油或成分(如姜黄精油[6]、孜然精油[7])已经被开发成为食品抑菌剂。天然酚类香料也主要来源于植物，成分相对安全，在改善食品风味的同时，还可发挥杀菌、防腐的作用[8]，在20世纪初被作为防腐剂添加在食品中。多数酚类香料被报道具有较好的抑菌活性，如丁香酚[9-10]、香芹酚[11]和百里香酚[12]等。Payne等[13]发现特丁基对苯二酚(TBHQ)和对羟基苯甲酸丙酯对李斯特菌的抑制效果都明显高于常用食品抗菌剂山梨酸钾。孙洁雯等[14]报道了23种酚类香料对4种常见细菌的抑菌活性，其中2-丙基苯酚、2-异丙基苯酚、4-丙基苯酚、香芹酚和百里香酚对4种供试细菌均有较强的抑菌效果。然而关于4-丙基苯酚对黄曲霉菌的熏蒸抑菌活性未见有研究报道。4-丙基苯酚是GB 2760—2014中允许添加的食品香料，在食用安全性方面具有明显优势。

本文以常用防腐剂山梨酸为阳性对照，筛选了国家标准中允许使用的7种酚类食品香料并对活性较好的4-丙基苯酚进行了研究，进一步分析其对黄曲霉菌的抑菌活性以及在花生储藏中的应用效果，为开发安全、高效的天然防腐剂或粮食防霉剂提供基础和依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2-丙基苯酚、4-丙基苯酚、2-异丙基苯酚、茶多酚、百里香酚、麦芽酚、乙基麦芽酚等酚类食品香料：上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇(分析纯)：天津市天力化学试剂有限公司；吐温80(化学纯)：天津市科密欧化学试剂有限公司；黄曲霉菌(CGMCC 3.6304)：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

沙氏培养基：蛋白胨10 g、琼脂20 g、葡萄糖40 g，蒸馏水定容至1 000 mL。

1.2 仪器与设备

LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗机械厂；XK96-A/B快速混匀器：江苏新康医疗器械有限公司；DHP-9052 电热恒温培养箱：河南兄弟仪器设备有限公司；SW-CJ-20 双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化及孢子悬浮液的制备

将黄曲霉菌接种于沙氏培养基上，(28±2)℃培养7 d，使用含0.1%吐温80的生理盐水洗脱并通过3层擦镜纸过滤菌丝得到孢子悬浮液[15]，采用血球计数板计数黄曲霉菌孢子，将孢子悬浮液浓度调整至106～108个/mL。

1.3.2 带药培养基法测定抑菌活性

参考Li等[16]使用的方法并稍做修改。根据设定浓度梯度，称取相应质量的酚类化合物，加入含10%吐温80的乙醇溶液(吐温80与无水乙醇体积比1∶9)中涡旋混匀，制成化合物母液。吸取1 mL母液滴加到无菌培养皿中与19 mL灭菌沙氏培养基混匀，冷凝后备用，吸取3 μL黄曲霉菌孢子悬浮液(108个/mL)接种至培养基中间，在(28±2)℃的恒温培养箱中培养6 d。酚类香料筛选质量浓度为0.2、0.4 mg/mL。选4-丙基苯酚质量浓度为0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mg/mL研究其最小抑菌浓度。未经酚类香料处理的培养皿(20 mL灭菌培养基)作为空白对照(CK)。每个处理设置3个重复，十字交叉法测量真菌生长直径。计算黄曲霉菌生长抑制率。

生长抑制率=(dc-dt)/dc×100%，

式中：dc、dt分别为对照组和试验组中黄曲霉菌生长平均直径，cm。

1.3.3 密闭熏蒸法测定4-丙基苯酚抑菌活性

参考 Boukaew等[17]使用的方法，在培养皿中倒入20 mL灭菌的沙氏培养基，待培养基冷凝后，吸取3 μL黄曲霉菌孢子悬浮液滴在培养基中间，将4-丙基苯酚添加到培养皿盖内侧的灭菌滤纸条上迅速密封，其在培养皿内的熏蒸质量浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL(化合物质量/培养皿内空气体积)。(28±2)℃培养6 d，抑菌活性测定方法同1.3.2。

1.3.4 4-丙基苯酚对储藏花生中黄曲霉菌的熏蒸抑菌活性

参考Prakash等[18]使用的方法，挑选颗粒饱满无霉菌污染的花生，75%酒精浸泡30 s，用无菌水漂洗4次去掉残留酒精。再将花生在黄曲霉菌孢子液中浸泡30 s，放置于超净工作台的无菌滤纸上，待其表面无残留流动液体，平放到培养皿中备用(每皿10～12粒)。添加4-丙基苯酚于培养皿盖内侧的灭菌滤纸上，熏蒸质量浓度为0.2、0.5、0.8、1.1 mg/mL，滴加4-丙基苯酚后立即密封，(28±2)℃培养7 d。每个处理设置3个重复。每隔24 h，统计花生污染黄曲霉数量。花生霉变率=污染的花生数量/花生总数量×100%。

1.3.5 4-丙基苯酚对储藏花生中黄曲霉菌的熏蒸杀菌活性

按照1.3.4方法准备花生样品，使无菌滤纸片上4-丙基苯酚的熏蒸浓度为0.8、1.1、1.4、1.7 mg/mL，(28±2)℃培养24 h后将花生移到新的灭菌培养皿中，密封后继续培养6 d。每隔24 h记录花生霉变数量，并计算霉变率。

1.4 数据分析

试验数据用平均值±标准差表示。采用 Origin 8.5和SPSS 20.0进行作图和数据分析。

2 结果与分析

2.1 7种酚类香料对黄曲霉菌生长的抑制活性

由表1可知，除麦芽酚外，大多数酚类香料对黄曲霉菌有不同的抑制效果。在0.2 mg/mL筛选质量浓度下，乙基麦芽酚、茶多酚、麦芽酚3种化合物抑菌率均为0%，4-丙基苯酚显示出良好的抑菌效果，抑制率为54.10%，约为阳性对照山梨酸(22.90%)的2倍。供试化合物在0.4 mg/mL时，抑制率较0.2 mg/mL时均有所升高，4-丙基苯酚、2-异丙基苯酚和2-丙基苯酚对黄曲霉菌的抑制效果最强，抑制率均为100%；其次是百里香酚，抑制率为90.10%；作为阳性对照，山梨酸的抑制率为60.10%；乙基麦芽酚和茶多酚的抑菌活性较弱，抑制率分别为23.30%和1.80%。抑菌活性筛选结果表明，供试的7种酚类食品香料中，4-丙基苯酚的抑菌效果最好，且明显优于阳性对照山梨酸。

表1 7种酚类香料对黄曲霉菌生长的抑制活性(7 d)

2.2 4-丙基苯酚对黄曲霉菌的最小抑菌浓度

采用带药培养基法，通过研究不同质量浓度4-丙基苯酚对黄曲霉菌丝生长的抑制作用，确定最小抑菌浓度。由图1a可知，随着培养时间的延长，黄曲霉菌落直径不断增大。与CK组相比，4-丙基苯酚在不同质量浓度下均可以延缓黄曲霉菌丝生长，且延缓程度呈浓度依赖性。质量浓度为0.25、0.30 mg/mL时，菌丝延迟生长了2～5 d，且培养6 d的菌落直径与CK组培养1 d的直径大小相当。浓度为0.35、0.40 mg/mL时，培养期间未见黄曲霉菌生长。

由图1b可知，4-丙基苯酚对黄曲霉生长的抑制效果呈剂量依赖性。当4-丙基苯酚质量浓度为0.20～0.30 mg/mL时，对黄曲霉的生长有不同程度的抑制作用，抑制率为54.1%～90.6%；当质量浓度继续增大到0.35 mg/mL及以上时，可完全抑制黄曲霉菌丝生长，抑制率达100%，由此可知4-丙基苯酚对黄曲霉的MIC为0.35 mg/mL。

2.3 4-丙基苯酚对黄曲霉菌的熏蒸抑制作用

由图2a可知，与CK组相比，密闭熏蒸条件下不同质量浓度的4-丙基苯酚对黄曲霉菌丝生长均具有一定的抑制作用，且随着熏蒸质量浓度的增大，对黄曲霉生长的抑制作用逐渐增强。在0.02、0.03 mg/mL质量浓度下，与CK组相比，菌丝生长延迟了1 d；0.04、0.05 mg/mL处理时，连续培养6 d黄曲霉菌落直径为0，其生长完全被抑制。

由图2b可知，4-丙基苯酚对黄曲霉的熏蒸抑制作用与其质量浓度呈正相关。在0.01、0.02、0.03 mg/mL质量浓度下的抑制率分别为14.4%、38.8%和91.6%；4-丙基苯酚质量浓度达到0.04 mg/mL及以上时，黄曲霉生长完全被抑制。由此可见，熏蒸条件下4-丙基苯酚对黄曲霉菌的MIC为0.04 mg/mL。此外，与带药培养基试验结果相比，4-丙基苯酚在密闭熏蒸法中可在较低浓度下抑制黄曲霉生长，表现出更强的抑菌效果，其原因可能与供试化合物在熏蒸条件下对微生物细胞具有更强的渗透作用有关[19]。

2.4 4-丙基苯酚对储藏花生中黄曲霉菌生长的熏蒸抑制作用

由图3a可知，不同质量浓度的4-丙基苯酚对储藏花生中的黄曲霉菌有一定的熏蒸抑制效果，且呈剂量依赖性。随着花生的储藏时间延长，霉变率不断升高；同时随着4-丙基苯酚质量浓度的升高，黄曲霉菌对花生的污染率出现不同程度的降低，7 d时，在0.2、0.5、0.8 mg/mL质量浓度下，花生霉变率分别为100%、72.7%、18.2%；1.1 mg/mL质量浓度下，花生的黄曲霉菌污染率为0%。图3b为4-丙基苯酚抑制黄曲霉菌污染花生的实物图，由图3b可以看出，4-丙基苯酚能有效抑制黄曲霉菌的生长，熏蒸质量浓度为0.5 mg/mL 时，花生上的黄曲霉菌明显变少，达到1.1 mg/mL时，花生上的黄曲霉菌生长完全被抑制，表明4-丙基苯酚熏蒸处理对储藏中花生的MIC为1.1 mg/mL。

2.5 4-丙基苯酚对储藏花生中黄曲霉菌生长的熏蒸杀菌活性

由图4a可知，4-丙基苯酚对花生中黄曲霉菌的污染具有显著的抑制效果。4-丙基苯酚熏蒸质量浓度为0.8、1.4 mg/mL时，储藏前熏蒸处理24 h能够在一定程度上延迟黄曲霉菌对花生的侵染，与CK相比可延迟1～2 d。质量浓度达到1.7 mg/mL时，储藏期间花生未发生霉变，表明在此质量浓度下熏蒸24 h可将花生上的黄曲霉菌孢子完全杀死，有效防止黄曲霉菌在花生上的侵染和生长。图4b为4-丙基苯酚熏蒸处理对花生中黄曲霉菌的杀菌效果实物图，可以看出，随着4-丙基苯酚质量浓度的增加，花生霉变率开始下降；当达到1.7 mg/mL时，可以完全抑制黄曲霉菌在花生上的生长，表明4-丙基苯酚熏蒸24 h对储藏花生中黄曲霉菌的MFC为1.7 mg/mL。

3 结论

本文研究了7种酚类食品香料对黄曲霉菌的抑制效果，通过带药培养基法的筛选，多数酚类香料表现出一定的抑菌活性，其中4-丙基苯酚效果最好，且明显优于阳性对照山梨酸。在此基础上，通过接触和熏蒸2种方式进一步研究了4-丙基苯酚在不同质量浓度下的抑菌效果，结果显示4-丙基苯酚在接触和熏蒸的条件下对黄曲霉生长的MIC分别为0.35 mg/mL和0.04 mg/mL，表明在熏蒸条件下对黄曲霉菌具有更好的抑制效果。此外，研究 4-丙基苯酚对花生储藏中黄曲霉菌污染的控制效果时发现熏蒸质量浓度为1.1 mg/mL时，4-丙基苯酚能够完全抑制黄曲霉菌孢子在花生上的侵染，1.7 mg/mL熏蒸24 h可将花生上的黄曲霉菌孢子完全杀死。因此，4-丙基苯酚对花生储藏中的黄曲霉菌污染具有很好的控制作用，有望开发成一种新型、安全、环保的粮食防霉剂或食品防腐剂，拓宽了其在食品中的应用范围和用途。目前关于酚类香料的抑菌机理尚不明确，Shen等[20]发现百里香酚处理能够诱导黄曲霉菌孢子产生过量的ROS和NO，最终导致黄曲霉死亡。此外，Dambolena等[21]指出亲脂性是酚类化合物抗真菌活性的关键特性，且酚类抗菌剂的作用机理与引起细胞膜受损以及营养物质渗漏从而导致微生物死亡有关。4-丙基苯酚具有开发成为天然、环保、安全的防腐防霉剂的潜力，目前还未有其抑菌机理的相关报道，值得进一步深入研究。