川芎、干姜和穿心莲提取物及其组合抑菌活性研究

赵 晴, 张智蕊, 徐凤波, 李庆山, 李 娇

(南开大学化学学院, 元素有机化学国家重点实验室, 天津 300071)

中草药提取物都具有一定的抑菌功效,且利用中草药提取物杀菌不易使植物病菌产生抗药性,对农作物安全,可有效避免化学合成农药造成的环境污染、农药残留等问题[1-2]。植物本身会产生丰富的抑菌物质,例如,萜类、生物碱类、黄酮类、苷类、皂甙、醌类、香豆素、木质素、芪类、酯类、酚类、醇类、甾类、有机酸及精油类等化合物。植物提取物对于土壤生态环境的影响较小,具有很大的开发价值和应用潜力[3-4]。川芎中含有有机酚酸类成分,其中阿魏酸、咖啡酸、绿原酸等具有广泛的抑菌活性;穿心莲中含有的黄酮类和二萜内酯类成分是穿心莲主要的抑菌成分[5-6];干姜中含有的精油类成分具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤、杀虫等多种生物活性[7-8]。唐杰等对川芎提取物体外抑菌活性和杀虫活性研究表明,其乙醇提取物对7种常见致病菌具有明显的抑制作用,对油菜蚜虫有触杀作用[9]。罗丹等研究发现,姜精油对番茄早疫病菌Alternariasolani、番茄灰霉病菌BotrytiscinereaPers.、番茄疮痂病菌Xanthomonascampestrispv.vesicatoria均有一定的抑制作用[10]。刘志祥等采用杯碟法对穿心莲提取物进行体外抗菌研究,结果表明,穿心莲提取物对金黄色葡萄球菌StaphyloccocusaureusRosenbach、枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis、大肠杆菌Escherichiacoli、黑曲霉Aspergillusniger、青霉Penicillium有明显的抑制效果[5]。之前的研究主要集中于单一中药提取物的抑菌活性,对于多种中药提取物组合的抑菌活性研究较少。经过文献调研和中药筛选,得出川芎、干姜、穿心莲均为常用中药,对于人体有较好的医用功效,且3种中药价格低廉,均具有一定的抑菌功效,故对川芎、干姜和穿心莲分别进行提取,并进行抑菌活性测试,探究3种中药提取物及其复配组合的抑菌功效,并对提取物进行化学成分分析和含量测定,结合文献分析抑菌机理,筛选出效果好的中药提取物杀菌组合用于防治植物病害。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1供试中药

本试验所用中药如表1所示,其中川芎、干姜、穿心莲均来自北京同仁堂,为中药饮片,采购后置于4℃冰箱中保存备用。

1.1.2供试菌种

本试验所用菌种如表2所示,5种植物真菌均由南开大学生测室提供。

1.2 方法

1.2.1中药提取

1.2.1.1川芎提取

中药川芎饮片用破壁机粉碎,细度约100目,在不锈钢釜中按料液比1∶8加入90%乙醇溶液,超声波辅助,加热回流2 h,冷却后离心过滤。滤渣按料液比1∶8加入90%乙醇溶液重复提取1次,合并两次提取滤液,减压浓缩脱除溶剂,得到醇提浸膏。

醇提浸膏加入5倍质量的水将其分散，然后加入15倍质量的乙酸乙酯萃取两次,合并两次萃取液,减压脱除溶剂,干燥,得到川芎提取物。产物回收率为10.33%。

表1 供试中草药

表2 供试真菌

1.2.1.2干姜提取

中药干姜饮片用破壁机粉碎,细度约100目。在索氏提取器中加入料液比1∶15的石油醚,90℃索氏提取6 h,冷却后抽滤,收集滤液,减压脱除溶剂,得到干姜提取物。产物回收率为3.89%。

1.2.1.3穿心莲提取

中药穿心莲饮片用破壁机粉碎,细度约100目。在圆底烧瓶中加入料液比1∶20的60%乙醇溶液,50℃加热4 h,冷却后抽滤,收集滤液,减压脱除溶剂,得到穿心莲提取物[11]。产物回收率为28.42%。

1.2.2抑菌效果测定

本文抑菌试验以水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、黄瓜枯萎病菌、花生褐斑病菌为测试对象,采用生长速率法测定川芎、干姜和穿心莲提取物及其组合的抑菌效果。具体试验步骤如下:

将冻存菌种于室温下复苏,用接种针挑取少量菌落至PDA平板中心区域,封口,无光照倒置培养于温度25℃、湿度73%的培养箱中。将川芎、干姜和穿心莲提取物及其组合先分别用二甲基亚砜(DMSO)溶解,再用1‰的吐温水分别稀释成5 000、1 000、500 mg/L的药液。用移液枪分别吸取1 mL药液加入到9 mL的PDA培养基中,制成最终浓度为500、100、50 mg/L的含药平板。水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、黄瓜枯萎病菌、花生褐斑病菌活化后用打孔器打取直径4 mm菌饼,置于含药平板内,每皿3块呈等边三角形摆放,每处理重复3次,以不加药剂做空白对照。将各处理于(24±1)℃培养箱内培养72 h后测量各处理菌落扩展直径,计算抑菌率。

抑菌率=(空白对照菌落增长直径-药剂处理菌落增长直径)/空白对照菌落增长直径×100%。

1.2.3提取物组合增效作用评价方法

采用Gowing方法[12]对杀菌剂混剂的协同增效作用进行判断。按Gowing方程进行评价。

Cexp=C1+C2(1-C1)。

Cobs=Cexp,混剂中各组分表现独立作用;

Cobs>Cexp,混剂中各组分表现增效作用;

Cobs

其中,Cexp为混剂对病菌抑制作用的预期水平(理论抑制率);C1和C2为单剂单独使用时对病菌实际抑制率;Cobs为试验测定的混剂对病菌的实际抑制率。

1.2.4色谱条件

1.2.4.1川芎提取物GC-MS条件

1) 气相条件[13]。HP-5ms(30 mm×0.25 mm×0.25 μm);进样量:1 μL;进样温度:270℃;分流比:30∶1;载气∶He(99.999%),流量:1 mL/min;程序升温:初始温度50℃,以4℃/min升至260℃,保持2 min,以20℃/min升至300℃,保持5 min。

2) 质谱条件[13]。电离方式为电子电离(EI),电子能量70 eV;离子源温度:230℃;四极杆温度:150℃;扫描方式:全扫描;质量范围:33～500 amu;溶剂延迟:3 min。

1.2.4.2干姜提取物GC-MS条件

1) 气相条件[14]。HP-5ms(30 mm×0.25 mm×0.25 μm),柱温45℃(保留2 min),以5℃/min升温至280℃,保持2 min;气化室温度250℃;载气为高纯He(99.999%);柱前压7.62 psi,载气流量1.0 mL/min,进样量1 μL,分流比20∶1,溶剂延迟3 min。

2) 质谱条件[14]。离子源为EI源;离子源温度230℃;四极杆温度150℃;电子能量70 eV;发射电流34.6 μA;倍增器电压1 120 V;接口温度280℃;质量范围20～450 amu。

1.2.4.3穿心莲提取物HPLC条件

色谱柱:ODS C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);以乙腈-水(18∶82,V/V)为流动相梯度洗脱。乙腈起始浓度18%，60 min时浓度为40%,流速1 mL/min。检测波长226 nm;进样量20 μL[15]。

1.2.5紫外(UV)条件

1.2.5.1川芎总酚酸UV条件[16]

1)标准曲线制备。准确称取5.00 mg阿魏酸,置于100 mL容量瓶中,加甲醇超声溶解,制得0.05 mg/mL对照品溶液。精密吸取阿魏酸对照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL,分别置25 mL容量瓶中,加甲醇至6 mL,加0.3%十二烷基硫酸钠2 mL,0.6%三氯化铁-0.9%铁氰化钾(1∶1)混合液1 mL摇匀,在暗处放置5 min,加入1 mol/L冰醋酸溶液,摇匀,暗处放置30 min,以不加阿魏酸的上述处理为空白对照,724 nm波长处测吸光度。以浓度(C)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,绘制标准曲线。计算回归方程为:A=0.299 29C+0.242 91,R2=0.961 91。

2)样品测定。准确称取川芎提取样品0.067 82 g,置100 mL容量瓶,加甲醇超声溶解,制得0.678 2 mg/mL样品溶液。精密吸取样品溶液2 mL于25 mL容量瓶中,加甲醇至6 mL,加0.3%十二烷基硫酸钠2 mL,0.6%三氯化铁-0.9%铁氰化钾(1∶1)混合液1 mL摇匀,在暗处放置5 min,加入1 mol/L冰醋酸溶液,摇匀,暗处放置30 min,724 nm波长处测吸光度,并用标准曲线的回归方程计算总酚酸含量。

1.2.5.2穿心莲总黄酮UV条件[11]

1)标准曲线绘制。准确称取芦丁标准试剂0.101 86 g,用甲醇溶解定容至100 mL,得到对照品溶液。精密吸取对照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL分别置于6个10 mL容量瓶中,用甲醇补充至5 mL,各加入5%的NaNO20.5 mL,室温放置6 min后,加入10%的Al(NO3)30.5 mL,室温放置6 min,再加入4%的NaOH 4.0 mL,室温放置15 min,以不加对照品溶液作为空白, 于 500 nm 处测定吸光度(A),以芦丁浓度(C)为纵坐标,吸光度为横坐标绘制标准曲线。得到回归方程:C=9.053 6A-0.089 5,R2=0.983 38,线性范围50.0～250 μg/mL。

2)样品溶液制备及总黄酮含量测定。准确称取穿心莲提取物0.201 99 g,用甲醇溶解定容至50 mL,得样品溶液。精密吸取供试品溶液5 mL于10 mL容量瓶中,加入5%的NaNO20.5 mL,室温放置6 min,加入10%的 Al(NO3)30.5 mL,室温放置6 min,再加入4%的NaOH 4.0 mL,室温放置15 min,于500 nm处测定吸光度,并用标准曲线的回归方程计算总黄酮含量。

1.2.6数据分析

所获抑菌率原始数据经Excel初步处理后,使用SPSS 26软件计算其平均值和标准误,并以平均值±标准误来表示。本试验有两个自变量,即提取物和提取物的浓度,本研究侧重于提取物及其组合对5种植物病原真菌抑制率的影响。所以将相同浓度下不同提取物对相同病原真菌的抑制率数据导入到SPSS软件中,采用LSD多重比较不同处理间的差异显著性(α=0.05)。

2 结果与分析

2.1 提取物及其组合对5种植物病原真菌抑制作用

川芎、干姜和穿心莲提取物及其组合对5种植物真菌的抑菌结果(表3)显示,相同浓度下不同提取物对水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、黄瓜枯萎病菌、花生褐斑病菌的抑制率均存在显著差异。通过比较不同抑菌浓度,发现在 500 mg/L 时,3种提取物及其组合对5种真菌的抑制率效果显著,部分抑制率最高达100%;比较单一提取物和提取物复配组合的抑菌活性,发现提取物组合对病原菌抑制率更高,抑菌谱更广,其中,在1∶1(m∶m)配比下,浓度为500 mg/L时,川芎+干姜提取物对5种植物病原真菌抑制率达83%以上,川芎+穿心莲提取物对5种植物病原真菌的抑制率达75%以上,干姜+穿心莲提取物对除黄瓜枯萎病菌以外的4种病原菌的抑制率达88%以上。

表3 川芎、干姜、穿心莲提取物及其组合对5种植物病原真菌的抑制作用1)

2.2 提取物组合增效作用评价结果

3种中药提取物组合对5种植物病原真菌的增效作用评价结果见表4。在1∶1(m∶m)配比下,川芎+干姜提取物在100 mg/L时增效作用明显,且对水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、黄瓜枯萎病菌4种植物病原真菌的抑制作用较强;川芎+穿心莲提取物在100 mg/L时,对水稻稻瘟病菌和水稻纹枯病菌的抑制作用较强且表现为增效作用;干姜+穿心莲提取物在500 mg/L时,对5种植物病原真菌均表现为增效作用，其中对水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、花生褐斑病菌的抑制作用较强。

表4 川芎、干姜、穿心莲提取物组合对5种植物病原真菌的增效作用评价

2.3 提取物成分检测与鉴定

2.3.1川芎提取物

2.3.1.1挥发性成分鉴定

川芎提取物经GC-MS联用仪分析,共鉴定出5种主要的挥发性化合物(表5)。以色谱峰面积归一法计算化学成分含量,其总离子流图见图1,其主要化学成分及其峰面积相对百分含量见表5。从表中可以看出川芎提取物中的化学成分主要为内酯类,其中含量最高的为藁本内酯,含量为57.21%,其次为(3s)-3-丁基-4,s-二氢-1(3H)-异苯并呋喃酮、新蛇床内酯、正丁基苯酞、3-正丁烯基苯酞,含量依次为30.50%、3.14%、2.27%、1.86%,总含量达90%以上,为川芎提取物中挥发性成分的主要组成部分。

2.3.1.2酚酸类成分含量测定

川芎提取物中含有的酚酸类如阿魏酸、咖啡酸、绿原酸均具有较好的抑菌功效,经UV分析,测得总酚酸含量为9.15%。

图1 川芎提取物GC-MS总离子流图Fig.1 GC-MS total ions chromatogram of Chuanxiong Rhizoma extracts

表5 川芎提取物主要化学成分

2.3.2干姜提取物成分分析鉴定

干姜提取物经GC-MS联用仪分析,共鉴定出15种化合物(表6)。以色谱峰面积归一法计算化学成分含量,其总离子流图见图2,其主要化学成分及其峰面积相对百分含量见表6。从表中可以看出干姜提取物中的化学成分主要为萜烯类、酮类、醛类、酚类,其中含量最高的4种为α-姜烯、β-倍半水芹烯、β-红没药烯、α-姜黄烯,均为倍半萜类化合物,含量分别为37.90%、13.27%、12.23%、10.03%,总含量达70%以上,为干姜提取物的主要化学成分。

图2 干姜提取物GC-MS总离子流图Fig.2 GC-MS total ions chromatogram of Zingiberis Rhizoma extracts

表6 干姜提取物主要化学成分

2.3.3穿心莲提取物

2.3.3.1穿心莲内酯含量测定

穿心莲主要抑菌成分为穿心莲内酯和黄酮。图3为对照品穿心莲内酯液相色谱图。穿心莲提取物经HPLC分析得到的色谱图如图4所示,1为穿心莲内酯峰。经计算,穿心莲提取物中穿心莲内酯含量为2.67%。

图3 穿心莲内酯对照品色谱分析Fig.3 Chromatographic analysis of andrographolide standard

2.3.3.2穿心莲黄酮含量测定

经UV分析,测得穿心莲提取物中总黄酮含量为4.85%。

3 结论与讨论

本试验结果表明,随着提取物浓度的增大,在500 mg/L时,3种中药提取物及其组合对5种真菌的抑制效果显著,抑菌谱更广,对部分病原菌的抑制率最高达100%;提取物组合与单一提取物相比,抑制率更高,抑菌谱更广,其中,在1∶1(m∶m)配比下,浓度为500 mg/L时,川芎+干姜、川芎+穿心莲提取物对5种植物病原真菌抑制率分别达83%和75%以上,干姜+穿心莲提取物对除黄瓜枯萎病菌以外的4种植物病原真菌的抑制率达88%以上。

图4 穿心莲提取物色谱分析Fig.4 Chromatographic analysis of Andrographis Herba extracts

利用Growing法对3种中药提取物复配组合进行增效拮抗作用评价,结果表明,2种中药提取物复配具有较好的协同增效作用,其中,在1∶1(m∶m)配比下,川芎+干姜提取物在100 mg/L时对水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、黄瓜枯萎病菌和花生褐斑病菌表现为增效作用;川芎+穿心莲提取物在100 mg/L时对水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌和花生褐斑病菌表现为增效作用;干姜+穿心莲提取物在500 mg/L时对水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、黄瓜枯萎病菌、花生褐斑病菌表现为增效作用。

利用GC-MS、HPLC和UV对川芎、干姜和穿心莲提取物进行成分分析和含量测定，结果表明，川芎提取物中的挥发性成分主要为内酯类,总含量达90%以上,其中含量最高的为藁本内酯,含量为57.21%,非挥发性抑菌成分酚酸类的含量为9.15%。干姜提取物中的化学成分主要为倍半萜类化合物,总含量达70%以上,其中含量最高的为α-姜烯，含量为37.90%。穿心莲提取物中主要的抑菌成分穿心莲内酯的含量为2.67%,黄酮的含量为4.85%。

真菌细胞壁位于细胞膜外层,具有保持营养物质、气体和酶自由通透及避免细胞受外界高渗透压的作用。细胞壁周围覆盖有脂多糖和外膜蛋白,限制疏水性化合物通过脂多糖层向胞内扩散，以减弱其对细胞膜的损害[17]。川芎酚酸类、穿心莲黄酮苷和二氢黄酮类亲水性强,亲脂性差,川芎内酯类、干姜倍半萜类、穿心莲二萜内酯类和部分黄酮类亲脂性强。川芎提取物与干姜提取物或穿心莲提取物复配组合,川芎提取物中亲水性的酚酸类成分可破坏由多糖构成的细胞壁结构,增大细胞壁的通透性,使亲脂性的川芎内酯类、干姜倍半萜类或穿心莲二萜内酯类和部分黄酮类成分顺利通过细胞壁,利用亲脂性破坏细胞膜,使细胞内容物渗出,导致菌体死亡,从而达到协同增效的作用。试验结果证明,川芎提取物同干姜提取物或穿心莲提取物等亲脂性提取物进行复配时在100 μg/mL时就能够起到很好的增效作用。

而当穿心莲提取物同干姜提取物进行复配时,浓度在500 μg/mL时才能达到较好的增效作用,抑菌机理可能是亲脂性的主要为干姜倍半萜类和穿心莲二萜内酯类,而穿心莲黄酮类化合物中的黄酮苷、二氢黄酮类具有一定亲水性,但是含量较低,需要较高的浓度才能对菌体产生作用。

川芎、干姜和穿心莲提取物两两复配,抑菌率和抑菌广谱性均优于单一提取物,并表现出优越的协同增效作用,为植物源杀菌剂的开发提供了较好的理论依据。