红树老鼠簕来源真菌Talaromyces flavus TGGP35次级代谢产物及其抗氧化活性

蔡 瑾，罗运展，刘 婧，张学龙，肖 媚，韦方芳，张子怡，郑彩娟*

（1.海南师范大学 热带药用资源化学教育部重点实验室，化学与化工学院，海南 海口 571158；2.海南师范大学 海南省热带药用植物化学重点实验室，海南 海口 571158）

红树来源的真菌由于其宿主生长环境的特殊性（高盐、高温、高压、强光照等）具有独特的代谢机制，能够代谢出结构新颖、生物活性显著的化学成分[1-2]。因此，红树来源真菌是先导化合物发现的重要资源[3]。Talaromyces属真菌可以代谢出结构新颖且生物活性显著的次级代谢产物，如对小鼠黑色素瘤细胞（B16 细胞）具有细胞毒活性的十氢化萘衍生物fusarielins O-P[4]和氧杂萘酮二聚体衍生物talaverrucin A[5]、具有显著α-葡萄糖苷酶抑制活性的含硫酯苯甲酸酯衍生物eurothiocins C-H[6]、抗炎活性的环戊酮类化合物talarocyclopenta A 和衣康酸类化合物talarocyclopentas B-C[7]等。为从Talaromyces属中分离获得更多生物活性显著的次级代谢产物，本研究从一株来源于药用红树老鼠簕的内生真菌T.flavusTGGP35中分离得到7个化合物（1-7），结构分别鉴定为：physcion（1）、paeciloxanthone（2）、5-[（3E，5E）-3，5-nonadienyl]-1，3-benzenediol（3）、trans-ferulic acid（4）、3，4-二甲氧基甲苯（5）、对羟基苯甲醛（6）和对羟基苯乙酮（7）。化合物1-7的结构见图1。

图1 化合物1-7的化学结构Figure 1 Structures of compounds 1-7

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

GAA076 LC质谱仪，瑞士Bruker公司；Agilent 1100分析型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；EYELAN-100旋转蒸发仪，日本东京理化有限公司；YOKO-ZK 紫外分析暗，武汉药科新技术开发有限公司；Sephadex LH-20 凝胶，Amersham Blosclences 公司；Bruker AV-400 MHz 超导核磁共振仪，瑞士Bruker 公司；恒温水浴锅B-220，上海亚荣生化仪器厂；薄层硅胶GF254和柱色谱硅胶，青岛海洋化工厂，总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS法），海南科贸生物科技有限公司；实验操作过程中所使用的化学试剂均来自广州西陇化工股份有限公司。

1.2 菌株的分离与筛选

1.2.1 菌株来源

从药用红树老鼠簕（A.ilicifoliusL.）的茎中分离、鉴定、筛选出一株命名为TGGP35 的菌株。通过18S rRNA扩增和ITS区域测序，结合真菌的形态特征将该真菌鉴定为T.flavus；该序列数据已提交给GenBank，登录号为MT071116。该菌种现保存于海南师范大学化学与化工学院热带药用资源化学教育部重点实验室（PDA培养基，4 ℃保存）。

1.2.2 菌株的培养

菌株T.flavusTGGP35 经过活化后，分别接种到装有400 mL 马铃薯液体培养基（PDB）的2 个1L 锥形瓶中，恒温（28 ℃）振荡培养72 h以获得种子培养液。然后将种子培养液分别转移到装有200 mL PDB 培养基的50个1L锥形瓶PDB中，室温静置发酵30 d。

1.3 提取与分离

液体发酵产物采用乙酸乙酯萃取3次（萃取体积比1∶2），减压浓缩后得到总质量为10.6 g的初始浸膏。随后将浸膏通过正相硅胶柱（150～75 μm）梯度洗脱，用石油醚/EtOAc（V/V，梯度100∶0 →0∶100）和EtOAc/MeOH（V/V，梯度100∶0 →0∶100）作为洗脱剂，每瓶200 mL进行收集，最终经TLC分析、合并相同流分后得到7个组分（Fr.A-Fr.G）。组分Fr.B（1.5 g）采用正相硅胶柱（75～48 μm）层析，通过石油醚/EtOAc（9∶0→1∶1）的梯度进行洗脱分离，通过TLC分析合并为3个组分（Fr.B1-Fr.B3）。Fr.B2（0.8 g）进行Sephadex LH-20凝胶柱层析（V/V，石油醚-CHCl3-MeOH，2∶1∶1），然后经HPLC分析制备，得到化合物1（10.4 mg）、2（7.3 mg）和4（8.7 mg）。Fr.D（2.1 g）经Sephadex LH-20凝胶柱层析（CHCl3–MeOH，1∶1，V/V），得到5个组分（Fr.D1-Fr.D5）。Fr.D3（1.0 g）经正相硅胶（75～48 μm）梯度洗脱后[石油醚/EtOAc（8∶1 →0∶1）]，通过HPLC半制备纯化，得到化合物3（8.5 mg）和5（11.7 mg）。组分Fr.E（1.1 g）用正相柱硅胶柱（75～48 μm）梯度洗脱石油醚/EtOAc（V/V，梯度5∶1 →0∶1），得到3个组分（Fr.E1-Fr.E3）。Fr.E2（0.5 g）进行Sephadex LH-20凝胶柱层析和HPLC分析制备，得到化合物6（11.4 mg）和7（10.2 mg）。

1.4 抗氧化活性测试

采用ABTS方法[8]对化合物1～7进行抗氧化活性测试。PBS缓冲液作为空白对照，二甲基亚砜DMSO为阴性对照，trolox 为阳性对照；使用全波长功能酶标仪测试样品在734 nm波长处的吸光度A，每组样品设置3组平行对照。根据公式计算各样品的抑制率：抑制率=[（A空白-A样品）/A空白]×100%，再通过SPSS软件计算出IC50值。

2 结果与讨论

2.1 化合物结构鉴定

化合物1：白色粉末状固体。阳离子ESI-MS 在m/z285.4 处给出准分子离子峰[M+H]+，确定分子量为284.0，结合1H和13C NMR 波谱数据，推断其相对分子式为C16H12O5，不饱和度为11。核磁波谱数据：1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δH13.50（1H，s，8-OH），7.60（1H，s，H-4），7.35（1H，d，J= 2.4 Hz，H-5），7.11（1H，s，H-2），6.72（1H，d，J= 2.4 Hz，H-7），3.92（3H，s，H-16），2.42（3H，s，H-15）;13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）:δC185.7（C，C-9），182.6（C，C-10），166.7（C，C-6），165.3（C，C-8），162.8（C，C-1），148.6（C，C-3），136.7（C，C-14），132.1（C，C-11），124.0（CH，C-2），121.5（CH，C-4），113.5（C，C-12），110.9（C，C-13），108.5（CH，C-5），105.1（CH，C-7），56.1（-OCH3，C-16），21.3（CH3，C-15）。根据其1H和13C NMR数据并与文献[9]报道数据比对，确定化合物1为physcion。

化合物2：黄色油状液体。阳离子ESI-MS 在m/z325.2 处给出准分子离子峰[M + H]+，确定分子量为324.0，结合1H和13C NMR波谱数据，推断其相对分子式为C20H20O4，不饱和度为13。核磁波谱数据：1H NMR（400 MHz，CDCl3）:δH12.54（1H，s，1-OH），7.46（1H，d，J=8.0 Hz，H-3），7.30（1H，s，H-5），7.17（1H，s，H-7），6.78（1H，d，J=8.0 Hz，H-2），5.32（1H，t，J=7.2 Hz，H-14），4.95（2H，t，J=7.2 Hz，H-11），4.44（1H，t，J=7.2 Hz，11-OH），3.51（2H，d，J=7.2 Hz，H-13），2.51（3H，s，H-12），1.81（3H，s，H-17），1.78（3H，s，H-16）;13C NMR（100 MHz，CDCl3）:δc184.6（C，C-9），160.1（C，C-1），158.2（C，C-10a），153.0（C，C-4a），147.4（C，C-6），142.7（C，C-8），137.2（CH，C-3），133.5（CH，C-15），127.3（CH，C-7），121.8（CH，C-14），119.2（C，C-4），118.1（CH，C-5），116.7（C，C-8a），110.3（CH，C-2），109.5（C，C-9a），65.4（CH2，C-11），27.6（CH2，C-13），25.9（CH3，C-16），22.1（CH3，C-12），18.1（CH3，C-17）。根据其1H和13C NMR并与文献[10]报道数据比对，确定化合物2为paeciloxanthone。

化合物3：白色粉末状固体。阳离子ESI-MS 在m/z233.5 处给出准分子离子峰[M+H]+，确定分子量为232.0，结合1H 和13C NMR 波谱数据，推断其相对分子式为C15H20O2，不饱和度为6。核磁波谱数据：1H NMR（400 MHz，CDCl3）:δH6.91（1H，t，J=2.4 Hz，H-2），6.76（1H，d，J=2.4 Hz，H-4），6.76（1H，d，J=2.4 Hz，H-6），6.12（1H，dd，J=14.8，6.4 Hz，H-10），6.02（1H，dd，J=14.8，10.4 Hz，H-10），5.73（1H，dt，J=14.8，6.4 Hz，H-9），5.53（2H，dt，J=14.8，7.0 Hz，H-13），2.72（2H，m，H-7），2.47（2H，m，H-8），1.94（2H，m，H-13），1.34（2H，m，H-14），0.83（3H，t，J= 7.0，H-15）;13C NMR（100 MHz，CDCl3）:δc156.8（C，C-1），156.8（C，C-3），145.2（C，C-5），133.1（CH，C-12），131.2（CH，C-9），131.0（CH，C-11），130.4（CH，C-10），108.2（CH，C-4），108.2（CH，C-6），100.5（CH，C-2），35.9（CH2，C-13），22.7（CH2，C-14），13.9（CH3，C-15）。根据其1H和13C NMR并与文献[11]报道数据比对，确定化合物3为5-[（3E，5E）-3，5-nonadienyl]-1，3-benzenediol。

化合物4：白色粉末状固体。阴离子ESI-MS 在m/z193.3 处给出准分子离子峰[M-H]-，确定分子量为194.0，结合1H 和13C NMR 波谱数据，推断其相对分子式为C10H10O4，不饱和度为6。核磁波谱数据：1H NMR（400MHz，DMSO-d6）:δH7.47（1H，d，J=15.8 Hz，H-7），7.31（1H，d，J=12.6 Hz，H-8），7.33（1H，s，H-5），7.26（1H，d，J= 7.5 Hz，H-2），6.42（1H，d，J= 8.1 Hz，H-3），3.81（3H，s，H-10）;13C NMR（100 MHz ，DMSO-d6）:δc168.3（C，C-9），149.0（C，C-1），147.9（C，C-6），144.0（CH，C-7），125.9（CH，C-8），122.7（CH，C-4），116.3（CH，C-2），115.6（CH，C-5），111.2（C，C-3），55.7（CH3，C-10）。根据其1H和13C NMR并与文献[12]报道数据比对，确定化合物4为trans-ferulic acid。

化合物5：白色粉末状固体。阴离子ESI-MS 在m/z151.7 处给出准分子离子峰[M-H]-，确定分子量为152.0，结合1H 和13C NMR 波谱数据，推断其相对分子式为C9H12O2，不饱和度为4。核磁波谱数据：1H NMR（400 MHz，CDCl3）:δH7.59（1H，dd，J= 8.4，2.4 Hz，H-2），7.53（1H，d，J= 2.4 Hz，H-5），6.90（1H，d，J=8.4 Hz，H-6），3.75（3H，s，H-7），3.83（3H，s，H-8），2.63（3H，s，H-9）;13C NMR（100 MHz，CDCl3）:δc149.6（C，C-3），149.5（C，C-4），131.4（C，C-1），123.4（CH，C-6），110.3（CH，C-5），110.1（CH，C-2），56.2（CH3，C-7），56.1（CH3，C-8），26.4（CH3，C-9）。根据其1H和13C NMR并与文献[13]报道数据比对，确定化合物5为3，4-二甲氧基甲苯。

化合物6：白色粉末状固体。阳离子ESI-MS 在m/z137.3 处给出准分子离子峰[M+H]+，确定分子量为136.0，结合1H 和13C NMR 波谱数据，推断其相对分子式为C8H8O2，不饱和度为5。核磁波谱数据：1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）:δH7.69（2H，d，J=6.4 Hz，H-3，5），6.13（2H，d，J=8.8 Hz，H-2，6），2.46（3H，s，H-9）;13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）:δc195.9（C，C-7），162.7（C，C-4），130.7（CH，C-6），130.2（CH，C-2），115.5（CH，C-5），115.4（CH，C-3），26.2（CH3，C-8）。根据其1H和13C NMR并与文献[14]报道数据比对，确定化合物6为对羟基苯甲醛。

化合物7：白色粉末状固体。阴离子ESI-MS 在m/z121.6 处给出准分子离子峰[M-H]-，确定分子量为122，结合1H 和13C NMR 波谱数据，推断其相对分子式为C7H16N2O2，不饱和度为4。核磁波谱数据：1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH9.82（1H，s，H-7），7.81（2H，d，J=7.2 Hz，H-3，5），6.37（2H，d，J=7.8 Hz，H-2，6）;13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）:δc190.6（C，C-7），164.3（C，C-4），132.7（CH，C-2，6），129.5（C，C-1）。根据其1H和13C NMR并与文献[14]报道数据比对，确定化合物7为对羟基苯乙酮。

2.2 抗氧化活性测试结果

对化合物1～7 进行了抗氧化活性测试，结果表明化合物6 具有显著的抗氧化抑制作用，且IC50为0.12 mmol/L 强于阳性对照药trolox（IC50=0.23 mmol/L），其余化合物在质量浓度为1mg/mL 时均无明显的抗氧化活性。

3 结论

本文运用多种色谱分离手段和波谱学方法，从一株老鼠簕（A.ilicifoliusL.）来源真菌T.flavusTGGP35中分离鉴定了7个已知化合物，包括1个蒽醌类化合物（1）、1个呫吨酮类化合物（2）、5个苯衍生物（3～7）。活性测试结果发现化合物6（对羟基苯甲醛）具有显著的抗氧化活性，其IC50值为0.12 mmol/L（强于阳性对照trolox IC50=0.23 mmol/L）。本研究从红树来源的Talaromyces属真菌中分离获得了具有抗氧化活性的次级代谢产物，为抗氧化剂的研发提供了科学依据。