基于NF-κB/Twist 1通路二甲双胍对GDM大鼠子代胎鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞EMT的作用机制*

段艳芳 刘风伟 秦业强 赵金梅 何文慧 姚晓玲

(沧州市人民医院产科，河北 沧州 061000)

妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus, GDM)是女性妊娠期常见的内科合并症之一，GDM常造成子代肺发育障碍，导致新生儿存活率降低[1]。Ⅱ型肺泡上皮细胞通过启动上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程使肺泡上皮细胞丧失上皮细胞表型，转化为间质细胞表型，从而发生肺纤维化，出现慢性阻塞性肺疾病和哮喘等[2-3]。二甲双胍(Metformin，Met)是常用的降糖药，临床研究表明，Met可安全有效的控制GDM患者血糖水平，改善母婴结局[4]。此外，Met可降低新生儿窘迫、高胆红素血症和巨大儿等发生率，有效改善GDM患者妊娠结局[5]。研究表明，Met可抑制TGF-β1或博来霉素诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞EMT[6]。核转录因子-κB(Nuclear transcription faction kappa B，NF-κB)/Twist1信号通路与EMT过程密切相关，研究发现，白杨素通过阻断NF-κB/Twist1信号通路逆转宫颈癌EMT过程，发挥抗癌作用[7]。白杨素通过调控NF-κB/Twist 1信号通路抑制博来霉素诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞EMT[8]。本研究探讨Met对GDM大鼠子代胎鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞EMT的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠15只，8周龄，体重200～220 g；雌鼠30只，8周龄，体重180～200 g；购自北京天诚医药科技有限公司，许可证号：SYXK(京)2016-0047。本研究经过我院伦理委员会审核通过。

1.2 试剂和仪器 Met和链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)购自美国Sigma公司；波形蛋白(Vimentin)、上皮钙粘蛋白(E-cadherin，E-cad)和神经钙粘蛋白(N-cadherin，N-cad)PCR引物购自上海生工生物工程股份有限公司；RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；NF-κB、p-NF-κB和Twist1蛋白抗体购自美国Abcam公司；倒置显微镜购自日本Olympus公司；电泳仪购自北京六一电子仪器公司；多功能酶标仪购自Bio-Rad公司。

1.3 模型制备[9-10]将30只雌鼠随机分为正常组(Normal组，10只)和GDM(20只)组，正常组雌鼠用普通饲料喂养，GDM组雌鼠用高脂饲料喂养，连续饲养4周后，将雌雄鼠按2∶1比例合笼，次日清晨进行阴道涂片，若发现精子则记为妊娠第0天，所有大鼠均受孕成功。GDM组受孕雌鼠腹腔注射1% STZ 30 mg/kg(溶于pH4.5的柠檬酸钠缓冲液，现配现用)，正常组受孕雌鼠腹腔注射柠檬酸钠缓冲液，3 d后，尾静脉采血检测雌鼠空腹血糖(FBG)水平(采血前禁食不禁水12 h)，FBG≥16.67 mmol/L视为GDM模型制备成功，其余鼠剔除，共造模成功18只。孕期GDM组雌鼠仍用高脂饲料喂养，17 d后所有雌鼠禁食不禁水12 h，尾静脉采血测定雌鼠FBG。将孕19 d的雌鼠腹腔注射戊巴比妥钠，消毒后剖腹取出胎鼠，超净工作台中迅速取出胎鼠肺组织，预冷PBS进行清洗，剪成体积为1 mm3的组织块，胰蛋白酶消化20 min，1200 r/min离心5 min，弃掉上清，0.1% Ⅳ型胶原酶消化15 min，筛网过滤，1200 r/min离心5 min弃上清，含胎牛血清的DMEM培养基将沉淀悬浮，将悬浮液接种于包被大鼠IgG的培养瓶中，置于培养箱中培养40 min，吸出未贴壁细胞，接种于培养瓶中，置于培养箱中培养40 min，重复上述操作3次。吸取未贴壁细胞，1200 r/min离心5 min，弃上清，用含20% 胎牛血清的培养基将细胞制成单细胞悬液，接种于培养瓶中置于培养箱内培养，用于后续实验。

1.4 MTT法检测细胞存活率 取对数生长期的GDM组细胞，制成浓度为2×105/mL的单细胞悬液，接种于96孔板，每孔100 μL，置于培养箱中培养48 h，分别加入浓度为0、20、40、60、80和100 μmol/L的Met处理48 h，每个浓度设置3个复孔，之后每孔加入20 μL(5 mg/mL)MTT溶液，继续培养4 h。弃掉上清，每孔加入150 μL DMSO，充分振荡，10 min后置于490 nm波长处测定吸光度(A)值，计算细胞存活率(%)=(给药组A值-对照组A值)/对照组A值×100%。后续实验选择细胞存活率接近50%的Met浓度(80 μmol/L)。

1.5 Transwell实验检测侵袭细胞数 取对数生长期的细胞，制成浓度为2×105/mL的单细胞悬液，接种于24孔板，每孔100 μL，置于培养箱中培养48 h，随机分为对照组(Control组)、GDM组和Met组，每组设置3个复孔。Met组细胞根据细胞存活率选择用80 μmol/L Met处理48 h，GDM组和Control组细胞不做处理。Matrigel基质胶与无血清培养基按照1∶3的比例稀释，Transwell小室上室每个微孔表面铺以40 μL稀释后的Matrigel胶，置于培养箱中4 h。每个上室中加入细胞悬液200 μL，下室中加入含20%胎牛血清的培养基600 μL，置于培养箱中培养48 h后，取出小室，清洗3次，湿棉签拭去上室中的细胞，4%多聚甲醛固定20 min，结晶紫染色20 min，预冷PBS清洗3次，显微镜下观察并计算侵袭细胞数。

1.6 qRT-PCR法检测细胞中各蛋白mRNA相对表达量 实验分组和处理方法同1.5。收集对数生长期的细胞，加入Trizol试剂提取细胞中的总RNA，测定RNA纯度和浓度，利用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板，进行荧光定量PCR反应，条件为95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共进行40个循环，2-△△CT法计算目的基因的相对表达水平。引物序列，见表1。

表1 引物序列

1.7 蛋白印迹法检测细胞中蛋白表达情况 实验分组和处理方法同1.5。收集对数生长期细胞，裂解、离心、取上清，BCA法测定蛋白浓度，煮沸变性。上样，120 V电泳至溴酚蓝到凝胶底部，0.3 A湿转2 h，将蛋白转至PVDF膜上，TBST洗膜3次，室温封闭1 h，4℃条件下p-NF-κB、NF-κB、Twist1和GAPDH抗体(1∶1000)孵育过夜，TBST洗膜3次，二抗(1∶5000)室温孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL法显色，Image J分析条带灰度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。

2 结果

2.1 雌鼠FBG检测结果 Normal组雌鼠FBG(5.24±1.06) mmol/L，GDM组雌鼠FBG(22.47±2.80) mmol/L，两组比较，差异有统计学意义(t=18.602,P<0.001)。

2.2 不同浓度Met对细胞存活率的影响 细胞存活率组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。细胞存活率随Met浓度的增加而降低，且具有剂量依赖性。见表2。

表2 不同浓度Met对细胞存活率的影响

2.3 Transwell实验检测结果 侵袭细胞数组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与Contorl组比较，GDM组侵袭细胞数增多(P<0.05)；与GDM组比较，Met组侵袭细胞数减少(P<0.05)。见图1、表3。

表3 各组侵袭细胞数比较

2.4 各蛋白mRNA相对表达量检测结果 E-cad、Vimentin和N-cad mRNA相对表达量组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与Contorl组比较，GDM组Vimentin和N-cad mRNA相对表达量升高，E-cad mRNA相对表达量降低(P<0.05)；与GDM组比较，Met组Vimentin和N-cad mRNA相对表达量降低，E-cad mRNA相对表达量升高(P<0.05)。见表4。

表4 各组细胞中E-cad、Vimentin和N-cad mRNA相对表达量比较

2.5 蛋白印迹法检测结果 p-NF-κB p65和Twist1蛋白相对表达量组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与Contorl组比较，GDM组p-NF-κB p65和Twist1蛋白相对表达量升高(P<0.05)；与GDM组比较，Met组p-NF-κB p65和Twist1蛋白相对表达量降低(P<0.05)。各组间NF-κB p65蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表5、图2。

表5 各组细胞中p-NF-κB p65和Twist1蛋白相对表达量比较

图2 细胞中蛋白表达Western blot图

3 讨论

GDM被定义为妊娠期发生或首次发现不同程度的糖耐量异常，常导致早产、流产或胎儿生长发育不全等严重后果，例如子代糖脂代谢紊乱和胰岛功能障碍，或子代易发生心肌缺血再灌注损伤[11-12]。GDM对子代有多种不良影响，如糖脂代谢异常、记忆和情绪障碍等[13-14]，此外，还导致胎鼠肺脏发育迟缓[15]，EMT发生于糖尿病多种并发症中，LncRNA SNHG11抑制高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞EMT过程，可降低细胞增殖和迁移能力[16]。高糖诱导肾小管上皮细胞发生EMT，促进糖尿病肾脏纤维化。Met是临床上常用的降糖药，此外，Met通过逆转EMT过程发挥抗癌作用已被广泛报道，例如肺癌和黑色素瘤等[17-18]。此外，二甲双胍通过提高糖尿病肾病早期自噬水平可降低肾小管间质纤维化[19]。基于以上研究，本实验通过建立GDM大鼠模型，分离胎鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞，探讨Met对Ⅱ型肺泡上皮细胞EMT过程的影响及其机制。

本研究通过测定GDM大鼠FBG水平，确定模型制备成功。不同浓度Met处理肺泡上皮细胞，细胞存活率降低，且具有浓度依赖性。E-cad、N-cad以及Vimentin是发生EMT的标志性蛋白，E-cad属于细胞黏附分子钙粘蛋白家族中的主要成员，在维持细胞间黏附性、细胞极性以及细胞间信息传递等方面发挥重要作用，它可通过促进细胞间连接，维持细胞骨架和连接支架稳定，是重要的上皮细胞标志物，E-cad表达下调标志着EMT的发生[20]。Vimentin是中间丝蛋白家族的重要成员，在正常上皮细胞中不表达，主要表达于间质细胞，对维持间质细胞结构完整性、抵御外界损伤具有重要作用[21]。N-cad在胚胎发育过程中高度表达，而在成熟哺乳动物中表达非常局限，N-cad和E-cad的表达往往成反向关系，因此，N-cad的表达与EMT的发生同样存在密切联系[22]。本研究结果显示：GDM组胎鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中E-cad mRNA表达降低，而N-cad和Vimentin mRNA表达升高，Met发挥相反的调节作用。结果提示：Met可逆转GDM胎鼠肺泡上皮细胞发生EMT。

Twist1是一种高度保守的碱性螺旋-环-螺旋结构的转录因子超家族中的一员，在胚胎发育以及EMT过程中发挥重要调控作用，激活Twist1可降低E-cad，同时升高N-cad和Vimentin[25]。Twist1激活受多种细胞因子的调节作用，其中由炎症因子诱导活化的NF-κB即是其中之一[26]。Wu等[27]研究发现COL11A1通过激活NF-κB/Twist1信号轴增强卵巢癌细胞化疗耐药性，抑制细胞凋亡。Tu等[28]研究发现，NF-κB/Twist1信号通路参与人乳头状甲状腺癌EMT过程。因此，本研究采用蛋白印迹法检测NF-κB/Twist1信号通路在Ⅱ型肺泡上皮细胞中的表达情况。结果显示：GDM组细胞中p-NF-κB p65和Twist1蛋白相对表达量升高，而Met组二者表达降低，结果表明Met可抑制NF-κB/Twist1信号通路。

4 结论

Met可抑制GDM大鼠子代胎鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞EMT过程，其可能是通过抑制NF-κB/Twist1信号通路发挥作用，为临床治疗GDM子代肺损伤提供理论依据。