右美托咪定抑制Ca2+超载保护大鼠脊髓缺血再灌注损伤

姜 胜，杨少青，王雨欣，宋泉江，周 彬，邵春艳，王晓杜，宋厚辉

(浙江农林大学 动物科技学院/动物医学院，浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程实验室/动物医学与健康管理浙江省国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室,浙江 杭州 311300)

脊髓缺血再灌注(spinal cord ischemia-reperfusion，I/R)可以造成不可逆的中枢神经系统损伤，导致神经出现进行性损伤和功能障碍，最终造成后肢瘫痪等并发症[1-3]，给动物及其畜主带来巨大负担。脊髓I/R损伤的发生与发展与细胞内Ca2+超载、细胞凋亡、活性氧的过度生成等多种因素有关，其中Ca2+超载被认为是脊髓I/R损伤的主要原因[4]。Ca2+是钙敏感受体(calcium-sensing receptor，Ca-SR)的配体，它可以作为细胞外的第一信使，激活脊髓神经元和神经胶质细胞中CaSR的表达[5-6]，而激活的CaSR会诱发Ca2+超载，这可能是神经元缺血再灌注损伤后发生凋亡的原因[5]。钙调蛋白激酶Ⅱ(CAMKⅡ)是Ca2+信号调控的关键因子，可维持细胞内钙离子稳定。当神经元活动诱导细胞内Ca2+浓度升高时，即可激活CAMKⅡ[7-9]，而CAMKⅡ又可以诱发神经元Ca2+超载，诱导神经元凋亡[10]。

右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)是一种具有镇静和镇痛作用的高效选择性的α2-肾上腺素受体激动剂，被广泛应用于临床麻醉和危重病例的治疗中[11]。研究显示，除具有镇静、镇痛效应外，Dex还具有器官保护作用，Dex可以通过抑制肾交感神经及抗利尿激素的分泌增加尿量发挥对肾脏I/R损伤的保护作用[12-13]，还可通过α2AR/PI3K/AKT途径减轻I/R诱导的肺细胞凋亡[14]。此外，Dex还可以通过抑制p38 MAPK介导的线粒体凋亡和炎症反应保护肠道免受I/R损伤[15]。尽管有充分证据表明，Dex对多器官缺血再灌注损伤具有保护效应[16]，然而Dex是否可通过影响CaSR和CAMKⅡ的表达，调节神经元钙离子浓度减轻脊髓I/R损伤，尚不清楚。为此，本研究拟探讨Dex对脊髓I/R损伤的影响，并确定其保护效应是否与Ca2+超载有关，以期为Dex在脊髓损伤治疗中的潜在应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂大鼠(42只，雄性，体质量180～220 g)购自杭州子源实验动物科技有限公司；Dex(多咪静)购自硕腾生物科技有限公司；舒泰购自维克贸易(上海)有限公司；CaSR的抗体购自英国Abcam；CAMKⅡ的抗体购自美国Cell Signaling Technology；KN93与NPS2143抑制剂购自上海Selleck；Goat anti-Rabbit IgG(H+L)Secondary Antibody(HRP)购自杭州联科生物技术有限公司；钙检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；HiScriptⅢ All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR与AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2 动物分组将42只大鼠随机分为7组：假手术组(Sham)、缺血再灌注组(I/R)、Dex干预缺血再灌注组(Dex)、NPS2143(CaSR抑制剂)对照组(NPS2143)、NPS2143缺血再灌注组(NPS2143+I/R)、KN93(CAMKⅡ抑制剂)对照组(KN93)，KN93+缺血再灌注组(KN93+I/R)。再根据术后24 和48 h的时间细分，即Sham 24 h组、Sham 48 h组、I/R 24 h组、I/R 48 h组、Dex 24 h组、Dex 48 h组、NPS2143 24 h组、NPS2143+I/R 24 h组、NPS-2143 48 h组、NPS2143+I/R 48 h组、KN93 24 h组、KN93 48 h组、KN93+I/R 24 h组、KN933+I/R 48 h组，共14个亚组，每组3只大鼠。

1.3 脊髓缺血再灌注模型建立大鼠术前禁食禁水12 h并称质量，术中腹腔注射舒泰50(60 mg/kg)，待大鼠麻醉后，将其仰卧位固定于手术台上剃毛消毒，使用改良浦梦安等[17]方法建立大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型。将肠管移出腹腔，找到大鼠腹主动脉分支肠系膜上动脉及右肾动脉，使用动脉血管夹夹住这2条动脉之间的腹主动脉，阻闭血管50 min，随后松开血管夹，恢复血液灌注，用无菌温生理盐水冲洗大鼠腹腔，并还纳胃肠，逐层关闭腹腔，并用碘伏消毒创口。

1.4 各组药物处理Sham组：打开腹腔，分离出腹主动脉后，等待50 min 随后关闭腹腔；I/R组：打开腹腔，找到腹主动脉后，用血管夹夹闭50 min，然后松开血管夹恢复血液灌注，关闭腹腔；Dex组：在开腹前30 min，将Dex按(10 μg/(kg·h)通过尾静脉注射于大鼠体内，后续步骤同I/R组;NPS2143组，术前48 h，通过腹腔注射NPS2143(0.1 mg/kg)，后续步骤同Sham组;NPS2143+I/R组，术前48 h，通过腹腔注射NPS2143，后续步骤同I/R组；KN93组，术前48 h，通过腹腔注射KN93(5 mg/kg)，后续步骤同Sham组;KN93+I/R组，术前48 h，通过腹腔注射KN93，后续步骤同I/R组。

1.5 取样将术后24及48 h的大鼠安乐死，随后剃除其背部毛发，背中线切开背部皮肤与肌肉，暴露大鼠脊柱，并定位节段，用剪刀剪下L2段腰椎，再用咬骨钳打开椎管，取出完整的脊髓组织，分为3份，2份立即冻存于-80℃，1份用4%甲醛溶液中固定。

1.6 评价指标

1.6.1大鼠脊髓损伤行为学评分(basso-beattie-bresnahan，BBB评分) BBB评分定义：将动物置入开口盆，轻敲盆壁，使其爬行，观察动物的臀、膝、踝关节行走、躯干运动及其协调情况[18]。

三个人扔掉光溜溜骨头，把手伸进桶里，一次次捞，飞快地唆肉。饥饿感过去，何良诸才感觉到，防爆灯亮着，生活在光明里了。何良诸第一个愿望，就是看看盗墓者和年轻人。何良诸一惊，两个人的头发、胡子长得一塌糊涂，一只是老猴子，一只是小猴子。他们互相盯视，觉得陌生极了。何良诸想笑笑，脸皮僵硬，笑不出来。

1.6.2脊髓组织病理学结构变化 取适量脊髓组织于4%的甲醛溶液中固定，常规脱水，石腊包埋，制备切片，HE染色后光学显微镜下观察脊髓显微结构变化。

1.6.3脊髓组织Ca2+浓度变化 将脊髓组织制备成10%的匀浆，4℃离心取上清备用，后续步骤根据钙离子检测试剂盒说明书进行操作。

1.6.4脊髓组织CaSR和CAMKⅡ蛋白表达的变化 样本制备：剪取适量脊髓组织，放入玻璃匀浆器内，加入200 μL含1%蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，冰浴研磨；充分研磨后，冰上静置10 min使其充分裂解，随后放入4℃离心机12 000 r/min 离心5 min，离心后吸取上清液，利用BCA试剂盒检测上清浓度，最终定量为20 μg，沸水浴10 min，水浴结束后离心分装，-80℃冻存。

蛋白含量表达检测：通过SDS-PAGE电泳后，采用湿转法将目的蛋白从凝胶转移至PVDF膜上，随后依次孵育5%脱脂奶粉、一抗及二抗，最后在膜上滴加ECL显色液放入化学发光成像系统的仪器中成像。用Image J软件进行蛋白条带灰度值分析，最终计算出目的蛋白相对表达量。

1.6.5脊髓组织CaSR和CAMKⅡ基因水平检测 将脊髓组织分组后用TRIzol法提取总RNA，然后反转录成cDNA。以cDNA为模板，GAPDH为内参，按照AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix的说明书进行qPCR反应，检测CaSR和CAMKII的基因表达水平。研究中使用的引物由有康生物生物技术公司合成，研究中使用的引物详情见表1。

表1 引物序列

1.7 统计学方法试验所得数据表示为“均值±标准误”，使用GraphPad Prism 8.0软件进行数据制图，实验数据采用单因素方差分析，运用T检验进行数据配对差异分析，P<0.05标记为差异显著，P<0.01标记为差异极显著。

2 结果

2.1 BBB评分结果由图1A可知，与Sham 24 h组比较，I/R 24 h组、Dex 24 h组、NPS2143+I/R 24 h组，KN93+I/R 24 h组BBB评分均显著降低(P<0.01)；与I/R 24 h组比较，Dex 24 h组BBB评分显著升高(P<0.01)；与NPS2143 24 h组比较，NPS2143 I/R 24 h组蛋白的表达水平显著降低(P<0.01)。

由图1B可知，与Sham 48 h组比较，I/R 48 h组，KN93+I/R 48 h组BBB评分均显著降低(P<0.01)，Dex 48 h组BBB评分未见显著差异(P>0.05)，NPS2143+I/R 48 h组BBB评分显著降低(P<0.05)；与I/R 48 h组比较，Dex 48 h组与KN93 48 h组BBB评分显著升高(P<0.01)，KN93+I/R 48 h组BBB评分显著升高(P<0.05)。

与Sham组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01；与I/R组比较，#表示P<0.05，##表示P<0.01。下图同。

图2 缺血再灌注24 h脊髓组织病理学结构变化(200×)

由图3可见，Sham 48 h组神经纤维结构排列规则，形态结构未见明显异常；I/R 48 h组可见少量神经元胞体固缩(蓝色箭头)，胞核结构不清，染色加深，甚至消失(黑色箭头)；Dex 48 h组可见少量神经元胞体固缩(蓝色箭头)，胞核结构不清，染色加深，甚至消失(黑色箭头)；NPS2143 48 h组神经纤维结构排列规则，形态结构未见明显异常；NPS2143+I/R 48 h组可见少量胶质细胞增生轻度(绿色箭头)，少量神经元胞质空泡化(黄色箭头)；NPS2143 48 h组，神经纤维结构排列规则，形态结构未见明显异常；KN93+I/R 48 h组可见少量神经元胞体固缩(蓝色箭头)，胞核结构不清，染色加深，甚至消失(黑色箭头)。

图3 缺血再灌注48 h脊髓组织病理学结构变化(200×)

2.3 脊髓组织Ca2+浓度变化由图4A可知，与Sham 24 h组比较，I/R 24 h组、Dex 24 h组、NPS2143+I/R 24 h组，KN93+I/R 24 h组钙离子浓度极显著升高(P<0.01)；与I/R 24 h组比较，Dex 24 h组Ca2+浓度极显著降低(P<0.01)；与NPS2143 24 h组比较，NPS2143+I/R 24 h组Ca2+浓度极显著升高(P<0.01)；与KN93 24 h组比较，KN93+I/R 24 h组Ca2+浓度显著升高(P<0.05)。

由图4B可知，与Sham 48 h组比较，I/R 48 h组、NPS2143+I/R 48 h组，KN93+I/R 48 h组Ca2+浓度极显著升高(P<0.01)，Dex 48 h组Ca2+浓度显著升高(P<0.05)；与I/R 48 h组比较，Dex 48 h组Ca2+浓度无显著性差异(P>0.05)，NPS2143 48 h组Ca2+浓度显著降低(P<0.05)，NPS2143+I/R 48 h组Ca2+浓度极显著性升高(P<0.01)，KN93 48 h组Ca2+浓度无显著性差异(P>0.05)。

图4 缺血再灌注24 h(A)和48 h(B)脊髓组织Ca2+浓度变化

2.4 脊髓组织CaSR 和CAMKII蛋白表达变化由图5A、C可知，与Sham 24 h组比较，I/R 24 h组大鼠脊髓组织CaSR蛋白的表达水平极显著升高(P<0.01)，Dex 24 h组与NPS2143+I/R 24 h组蛋白表达水平无显著性差异(P>0.05)；与I/R 24 h组比较，Dex 24 h组与NPS2143+I/R 24 h组大鼠脊髓组织CaSR蛋白的表达水平极显著降低(P<0.01)；与Sham 48 h组比较，I/R 48 h组、Dex 48 h组与NPS2143+I/R 48 h组大鼠脊髓组织CaSR蛋白的表达水平无显著性差异(P>0.05)；与I/R 48 h组比较，Dex 48 h组大鼠脊髓组织CaSR蛋白的表达水平无显著差异(P>0.05)。

由图5B、D可知，与Sham 24 h组比较，I/R 24 h 组、Dex 24 h组与KN93+I/R 24 h组大鼠脊髓组织CAMKⅡ蛋白的表达水平极显著升高(P<0.01)；与I/R 24 h组比较，Dex 24 h组大鼠脊髓组织CAMKⅡ蛋白的表达水平极显著降低(P<0.01)；与KN93 24 h组比较，KN93+I/R 24 h组蛋白的表达水平极显著降低(P<0.01)；与Sham 48 h组比较，I/R 48 h、Dex 48 h、KN93+I/R 48 h组大鼠脊髓组织CAMKⅡ蛋白的表达水平无显著性差异(P>0.05)；与I/R 48 h组比较，Dex 48 h组大鼠脊髓组织CAMKⅡ蛋白的表达水平无显著性差异(P>0.05)；与KN93 48 h组比较，KN93+I/R 48 h组蛋白的表达水平无显著性差异(P>0.05)。

图5 脊髓组织CaSR(C)和CAMKⅡ(D)蛋白表达变化

2.5 脊髓组织CaSR和CAMKII基因水平变化由图6A可知，与Sham 24 h组比较，I/R 24 h、NPS2143 I/R24 h组大鼠脊髓组织CaSR mRNA的表达水平极显著升高(P<0.01)，Dex 24 h组mRNA表达水平无显著性差异(P>0.05)；与I/R 24 h组比较，Dex 24 h组大鼠脊髓组织CaSR mRNA的表达水平极显著降低(P<0.01)，NPS2143+I/R 24 h组CaSR mRNA表达水平显著降低(P<0.01)；与Sham 48 h组比较，I/R 48 h组大鼠脊髓组织CaSR mRNA的表达水平显著升高(P<0.05)。

由图6B可知，与Sham 24 h组比较，I/R 24 h组大鼠脊髓组织CAMKII mRNA的表达水平显著升高(P<0.05)。

图6 脊髓组织CaSR(A)和CAMKⅡ(B)mRNA变化

3 讨论

脊髓缺血再灌注损伤是脊柱手术中常见的中枢神经系统损伤，给动物的健康造成了巨大影响[19]。Dex是一种高选择性、高特异性的α2肾上腺素受体激动剂，其选择性强，半衰期短，具有镇静、镇痛、抑制交感神经活性等作用[20-21]，越来越多的证据表明，Dex除了在炎症反应和氧化应激方面具有重要调节作用外，在中枢神经系统损伤的保护方面也起着重要作用[22-24]，但关于Dex对脊髓I/R损伤的保护作用及机制研究报道较少。本研究结果显示，Dex预处理能显著减轻脊髓I/R损伤，改善组织病理学变化，表明Dex对脊髓I/R损伤有一定的预防作用。脊髓损伤后动物的运动能力评估直接反映了脊髓修复与再生水平，以及外周行为功能的改善情况[25]。BBB评分体系分级细致，能够客观、精确地评估大鼠脊髓缺血再灌注后出现的行为学变化，且与脊髓损伤的程度高度相符，是目前许多研究者较为推崇的一种大鼠后肢恢复过程中行为学变化的评价方法[26-27]。结果显示，I/R组BBB评分显著降低，而Dex预处理后BBB评分显著提升，表明Dex预处理有利于脊髓I/R大鼠协调能力的恢复，显著提高大鼠运动功能评分，明显改善大鼠运动功能。脊髓组织病理切片结果可见，I/R组与Dex组脊髓神经元发生不同程度损伤，I/R组结果显示神经纤维结构排列不规则，形态结构出现明显异常，胶质细胞增生，神经元胞体固缩，胞核结构不清，染色加深，有的甚至消失，但相对于I/R组，Dex预处理组病理学损伤程度明显减轻，与NPS2143+I/R组和KN93+I/R组结果一致，说明Dex预处理能够缓解脊髓I/R损伤。组织病理学结果与BBB评分结果一致表明Dex预处理对脊髓缺血再灌注损伤有保护作用。

Ca2+对细胞的许多功能起着关键的调节作用，当脊髓I/R时，缺血缺氧的内环境会导致细胞膜上Ca2+通道过度开放、钙泵失活、突触末梢兴奋氨基酸释放导致Ca2+内流[28]，内流的Ca2+在线粒体上累积，激活MPT，引起自由基生成增加和生物能量衰竭，导致细胞坏死或凋亡[29]，因此可通过检测脊髓中Ca2+的含量来评估脊髓损伤情况。本研究结果显示，脊髓发生I/R损伤后24 h内组织中Ca2+浓度显著升高，而Dex预处理能够显著抑制Ca2+浓度的升高，表明Dex预处理对脊髓I/R损伤的保护作用可能与抑制Ca2+浓度超载有关。

CaSR广泛表达于神经系统[30]，是维持细胞内钙稳态的重要介质，与钙超载呈现正相关性[31-32]。CAMKⅡ既能参与转录、分泌、细胞骨架重组等活动，又是细胞内重要的Ca2+调节激酶[33]。CAMKⅡ失活可以抑制钙超载，从而对细胞起到保护作用[34-36]。小鼠局灶性脑缺血再灌注试验证实，CaSR激活后引起神经功能恶化，加重脑水肿和脑损伤程度，使用CaSR抑制剂NPS2143干预后，神经炎症减轻，脑神经功能改善[6,37]。研究还发现CaSR激活后可上调CAMKⅡ表达活性，进而激活NLRP3炎症小体[38-39]，加重脑损伤，而应用NPS2143和KN93能够抑制CaSR和CAMKⅡ，显著抑制NLRP3炎症小体产生，减轻脑损伤，以上研究表明，CaSR和CAMKⅡ激活会加重缺血再灌注损伤[37]。在本试验中发现，I/R 24 h组CaSR和CAMKⅡ蛋白与基因水平表达量显著上调，而Dex 24 h组预处理后，CaSR和CAMKⅡ表达量显著下降，这一结果也与总Ca2+浓度变化趋势一致。为了确定CaSR与CAMKII的激活是否是缺血再灌注损伤的机制，使用其抑制剂NPS2143和KN93进行抑制，结果表明，NPS2143和KN93抑制后可下调CaSR的表达量，明显改善组织病理学损伤，显著提升BBB评分，表明Dex与抑制剂作用一致。以上结果充分表明CaSR与CAMKⅡ参与了缺血再灌注损伤机制，Dex可通过下调CaSR和CAMKⅡ的表达来发挥对脊髓缺血再灌注的保护作用。

综上所述，Dex可下调CaSR和CAMKⅡ的基因与蛋白表达水平，减轻钙超载，从而保护脊髓缺血再灌注损伤，为Dex减轻脊髓I/R损伤的临床应用提供了理论依据。

附录1 BBB评分标准