槲皮素缓解内质网应激(ERS)介导的水牛颗粒细胞凋亡

杨潍菡，刘润峰，张俊俊，黄星晨，张鹏飞，黄良凤，张 明

(广西大学 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西 南宁530004)

内质网做为细胞内最大的Ca2+储存场所，同时也是蛋白质合成、加工的场所。内质网的稳态，对机体维持正常的生理活动至关重要[1]。当内质网稳态失衡时，便会产生内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)，使蛋白质错误折叠，此时内质网开启未折叠蛋白反应(unfolded protien response,UPR)，使内质网重回稳态[2]。而持续的ERS便会激活内质网上存在的3种UPR受体蛋白PERK、ATF6、IRE1[3]，分别通过 PERK激活下游CHOP基因，CHOP基因促进BAX(促凋亡基因)的表达，抑制BCL-2(抗凋亡基因)的表达，介导凋亡的发生[4]。IRE1激活JNK基因，以及激活Caspase家族级联反应，促使凋亡的发生[5]。

ERS在疾病的发生发展中起着很重要的作用，近年研究发现ERS是诱导颗粒细胞发生凋亡的关键途径之一。小鼠试验表明ERS在促使小鼠卵巢颗粒细胞凋亡中起关键作用[6]。而颗粒细胞的凋亡是卵泡闭锁的主要诱因，在生产上极大地制约着优良品种的利用，造成优良母畜资源的浪费。因此，抑制颗粒细胞凋亡，对延长雌性动物的使用年限至关重要。

槲皮素(quercetin,QC)，又被称为槲黄酮，是植物源性的黄酮类化合物，易溶于甲醇、冰醋酸等有机溶剂，不溶于水[7]。广泛存在于蔬果中，具有抗菌、抗病毒、降血糖、抗氧化等作用[8]。奶牛乳腺上皮细胞的探究试验中发现，QC可提升细胞的抗氧化能力，同时对细胞增殖也有着促进作用[9]；还有研究显示，QC能修复因镉损伤鸡的颗粒细胞功能，保护蛋鸡的生产性能[10]；此外，QC还能降低山羊精子和植入前胚胎中镉离子的含量，提高山羊精子体外保存品质，促进植入前胚胎的发育[11]；QC在牛的精液中可作为活性氧基团(ROS)清除剂和金属螯合剂，防止牛精液质量发生变化，保持精液正常的生殖功能[12]；QC还能缓解仔猪在运输过程中应激而造成得肠道损伤，保证其正常的生长性能[13]。上述研究均表明，QC在养殖业中具有较高的应用价值。

本试验以水牛的颗粒细胞做为研究对象，分析QC对水牛颗粒细胞的保护作用。通过衣霉素(tunicamycin，TM)构建ERS模型，探究QC对模型条件下水牛颗粒细胞凋亡的影响，为延长母畜使用年限提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验样本水牛卵巢取自南宁市肉联厂屠宰分厂。

1.2 主要试剂CCK-8细胞增殖检测试剂盒、Annexin-V/FITC细胞凋亡试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；qPCR酶,反转录试剂盒购自TaKaRa;TM购自索莱宝科技有限公司(北京)；QC购自上海源叶生物技术有限公司；水牛多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥有限公司。

1.3 溶液的配制取1 g TM，将其溶于1 L DMSO中，配制成40 g/L的母液，用完全培养基将其稀释至所需浓度；取1 g QC，将其溶于1 L DMSO中，配制成50 g/L的母液，再用完全培养基将其稀释至所需浓度。

1.4 卵巢颗粒细胞的收集取预热的生理盐水清洗水牛卵巢，而后用一次性注射器抽吸水牛卵巢上的卵泡，将抽取到的卵泡液1 500 r/min，离心5 min，收集水牛颗粒细胞沉淀，D-PBS清洗细胞沉淀，过40 μm细胞筛，反复2次，用完全培养液将颗粒细胞沉淀吹打混匀，进行铺板。6 h后更换完全培养基，观察细胞贴壁情况。

1.5 细胞免疫荧光在培养板中将已爬好颗粒细胞的玻片用D-PBS浸洗，用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，0.5%Triton X-100室温通透20 min D-PBS浸洗，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min；吸取封闭液，玻片上滴加足够量的FSHR一抗放入湿盒，4℃孵育过夜；D-PBS清洗，避光添加荧光二抗，湿盒中室温孵育1 h，D-PBS清洗后滴加DAPI避光孵育5 min，荧光显微镜下观察采集图像。

1.6 提高细胞活力取96孔板，每孔加入100 μL，2 000个细胞，待细胞贴壁完全后，添加QC到培养基中，使其终质量浓度为1.0，1.5，2.0，2.5，5.0，10.0，20.0 mg/L，37℃培养24,48，72 h。使用CCK-8试剂，按照说明书，进行操作，37℃孵育1 h，测定D450值，检测细胞活力情况，筛选出QC的最佳浓度。细胞活力(%)=(加药组-空白对照组)/(未加药组-空白对照组)×100%。

1.7 构建体外ERS模型使用TM构建ERS模型，将TM加入到培养基中，使其终质量浓度为1.0，1.5，2.0，2.5，5.0，10.0 mg/L，37℃培养48 h。使用Annexin-V/FITC凋亡试剂盒，通过流式细胞技术分析检测细胞凋亡情况，筛选出体外ERS模型的最佳浓度。

1.8 QC缓解ERS将筛选出的最佳QC浓度预处理水牛颗粒细胞8 h，而后添加TM构建ERS模型，37℃培养40 h，观察细胞情况。取1×106个处理后的细胞，制备成水牛颗粒细胞悬液，使用Annexin-V/FITC凋亡试剂盒，按照说明书进行细胞凋亡检测。

表1 引物序列

1.10 Western blot检测收集处理后的水牛颗粒细胞，提取细胞总蛋白，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。以内参蛋白Actin做为标准对照组，进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后转膜封闭，4℃孵育一抗过夜，TBST清洗3次，室温孵育二抗1 h，避光显色，图像分析。

2 结果

2.1 水牛原代颗粒细胞的收集与鉴定在体视显微镜下观察水牛颗粒细胞，细胞体积较大，轮廓清楚，细胞形态呈长纺锤形(图1A)；使用颗粒细胞上的特异性受体蛋白FSHR进行细胞免疫荧光，在荧光显微镜下观察发现，FSHR受体均表达在所培养的原代细胞的胞核及膜上(图1B)，证实本试验所提取、培养的细胞确系水牛颗粒细胞。

A.体视显微镜下观察水牛颗粒细胞的形态;B.荧光显微镜观察结果(绿光为颗粒细胞特异性受体蛋白FSHR;蓝光为DPAI)

2.2 QC对细胞活力的影响QC能提高水牛颗粒细胞的活力，在不同的处理时间中，QC处理细胞48 h，细胞活力最好；当QC质量浓度为1.0～2.5 mg/L 时，细胞活力有明显的提高，其中QC质量浓度为1.5，2.0 mg/L时(P<0.01)，细胞活力提高最为显著；而当QC质量浓度为5～20 mg/L时，细胞活力降低。表明，低质量浓度的QC能提高细胞活力，高质量浓度的QC降低细胞活力(图2)。

*P<0.05；**P<0.01。下同

2.3 体外ERS模型的构建TM是常用的ERS诱导剂，不同质量浓度的TM处理水牛颗粒细胞，使用Annexin-V/FITC检测细胞凋亡情况(图3A，B)。随着TM质量浓度的升高，凋亡细胞的数量上升。当TM质量浓度为2.5 mg/L时，凋亡细胞的数量与对照组相比差异极显著(P<0.01)。因此，选用TM质量浓度为2.5 mg/L构建体外ERS模型。TM处理后，检测细胞中ERS相关基因的表达情况，发现TM能促使ERS基因升高。表明TM能诱导ERS的发生。

A.不同质量浓度TM处理48 h,流式检测细胞凋亡情况;B.不同质量浓度TM处理24 h细胞凋亡情况统计图;C.TM处理后，ERS基因的表达情况

2.4 QC缓解ERSQC预处理之后水牛颗粒细胞凋亡情况如图4A,B所示。1.5，2.0 mg/L的QC预处理8 h之后，细胞凋亡情况与TM组相比显著降低，但未能完全恢复至正常水平。表明QC能缓解ERS而造成的细胞凋亡。

2.5 qPCR检测ERS和凋亡基因的表达qPCR检测ERS和细胞凋亡相关基因(图5)。结果显示，添加QC能降低ERS相关基因的表达(图5A)，其中PERK-ATF4-CHOP信号通路中的PERK、ATF4、CHOP基因的表达均极显著降低(P<0.01)，IRE-1A、ATF6基因的表达也降低(P<0.05)。随后对凋亡相关基因进行检测(图5B)，结果表明，添加QC能显著降低凋亡基因的表达。因此证明，QC能缓解因ERS而引起的细胞凋亡。

A.QC预处理后ERS相关基因的表达情况;B.QC预处理后细胞凋亡相关基因的表达情况

2.6 Western blot检测ERS和凋亡蛋白的表达Western blot检测结果证明(图6A，B)，TM能使Bax、Caspase 9等蛋白的表达水平升高，Bcl-2蛋白的表达水平降低，QC能促使BCL-2的表达升高，BAX、Caspase 9的表达降低。此外，对ERS中ATF4、Chop蛋白的表达水平进行检测，发现QC能缓解TM造成的蛋白表达水平升高。表明，添加QC能缓解因ERS而造成的细胞凋亡。

A.QC预处理后，ERS和凋亡相关蛋白表达情况；B.蛋白表达情况统计图

3 讨论

ERS在疾病的发生发展中起着重要作用，如阿尔茨海默综合征、高血压等。此外，ERS还发生在卵巢组织的细胞中，参与卵子的成熟、卵泡的形成。颗粒细胞的凋亡是卵泡闭锁的主要诱因[14]，卵泡闭锁又将导致卵巢早衰，而ERS在其中起着关键作用。

QC是一种植物源性的黄酮类化合物，具有抗氧，抗炎等多种生物活性。本研究发现，低浓度的QC能促进细胞的增殖，提高细胞的活力，这与QC在奶牛乳腺上皮细胞中促进细胞增殖的作用是相一致的[9]，为了探究QC能否缓解ERS引起的细胞凋亡，本试验在体外构建ERS模型，通过QC预处理发现，QC能缓解ERS诱导剂引发的细胞凋亡，这与QC通过ERS通路，作用于人脐静脉内皮细胞，使细胞的凋亡率降低，同时提高细胞活力的研究是相一致的[15]。GUO等[16]研究中发现，QC能通过ERS，缓解二甲基精氨酸诱导的肾小球内皮细胞凋亡，因此推断，QC可能通过ERS缓解水牛颗粒细胞凋亡，但具体的作用机制还需进一步研究。

ERS信号通路参与细胞凋亡主要通过调控Bax家族、caspase家族和Juk基因，试验发现QC预处理后，促凋亡基因Bax、Caspase3、Caspase 9的表达显著降低，抗凋亡基因Bcl-2的表达显著升高，蛋白表达情况与mRNA的表达相一致。此外，本研究还发现QC预处理后，ERS中PERK-ATF4-CHOP信号通路的表达与未用QC预处理组相比差异极显著，这与HU等[17]研究1，25-二羟基维生素D3通过抑制PERK-ATF4-CHOP信号通路缓解胰腺细胞凋亡一致。因此，判断QC缓解ERS介导的细胞凋亡可能主要通过PERK-ATF4-CHOP信号通路，但其具体的功能机制还需要进一步的研究。由上述可知，QC能缓解ERS引起的水牛颗粒细胞凋亡，对QC在生产上的使用提供理论依据。