聚乙烯醇-细菌纤维素复合可吸收生物屏障膜的制备及理化性能研究

赵正宜，肖剑虹，刘重远，邹多宏，2

引导性骨再生(guided bone regeneration, GBR)技术已经成为牙槽骨缺损修复与再生的常规及有效的治疗方案。目前临床常应用的屏障膜为可吸收生物膜，存在机械强度弱，容易穿孔并破裂等缺点[1]。聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)是一种由聚醋酸乙烯酯水解而成的，无色、无毒、无腐蚀性、可降解的水溶性有机高分子聚合物。PVA所表现出来的性能在生产、生活中具有相当广泛的应用，例如造纸、纺织品、粘合剂、涂料、薄膜以及药物输送等[2-4]。细菌纤维素(bacterial cellulose, BC)是一种天然纤维素，由醋酸杆菌、固氮菌、根瘤菌及假单胞菌等细菌产生[5]。BC不同于植物纤维素，其具有独特的结构特性，如高化学纯度、高杨氏模量、高吸水能力以及超细的网状纤维状结构，在医用敷料、组织工程及纳米合成功能材料等领域具有广泛的应用前景[6-7]。该研究主要采用溶液共混的方法将PVA与BC共混，制备PVA-BC可吸收生物屏障膜，并对其物理性能和生物相容性进行研究，探索其作为新型骨组织工程生物屏障膜的可行性，为将来临床应用提供一种选择。

1 材料与方法

1.1 实验材料PVA 1 750±50(上海国药集团化学试剂有限公司)，BC(生化级，阿拉丁生化科技股份有限公司，上海)，鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3细胞，中国科学院细胞库)。

1.2 试剂和仪器DMEM、胰酶消化液(美国Hyclone 公司)；胎牛血清(美国Gibco 公司)；CCK-8试剂盒(日本株式会社同仁化学研究所)；力学万能实验机(5565A，美国英斯特朗公司)；CO2孵箱(美国Thermo 公司)；扫描电镜(Supra40，德国蔡司公司)；X 射线衍射仪(X′Pert3 Powder，荷兰帕纳科公司)；傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet 8700，美国热电尼高力仪器公司)；酶标仪(美国Bio-tek 公司)。

1.3 薄膜制备首先配制1 g/L PVA溶液，称取PVA固体加入去离子水中，放入磁子，在90 ℃下搅拌3 h获得透明PVA溶液。将BC以不同含量加入到PVA溶液中，分别制备PVA∶BC质量分数比为10 ∶3、10 ∶5、10 ∶7、10 ∶9的溶液，搅拌2 h形成均匀的PVA/BC二元共混液，置于真空箱内多次去除气泡，然后将混合液倒入培养皿中，置于恒温加热台等待24 h干燥成膜，见图1。

图1 PVA-BC复合膜的合成方案及形貌

1.4 力学测试薄膜拉伸实验使用万能力学试验机(Instron 5565，美国) 进行测试，使用500 N重力传感器，速度为0.01 mm/s。条形样品(50 mm×3 mm) 在室温条件下进行拉伸。每组样品重复测试6次。取抗拉强度最大的复合膜组，重新制备待测样品后浸泡于去离子水中1 h，同样的方法测量湿态样品抗拉强度，最后绘制出相应的应力-应变曲线和断裂应力值图。

1.5 样品表征选取抗拉强度最大的复合膜组和纯PVA膜组样品，力学测试后收集断裂截面，经过制样、喷金等步骤，用扫描电镜观察两组截面的微观结构。采用X射线衍射分析仪扫描检测PVA、BC和PVA-BC薄膜，扫描速度为0.2°/min，在5°～55°(2θ)范围内进行分析。分别将PVA、BC和PVA-BC薄膜样品在傅里叶变换红外光谱仪上进行各成分分析，采集波长范围为500～4 000 cm-1。

1.6 细胞相容性实验采用CCK-8法测定薄膜对细胞增殖能力和活力的影响。取抗拉强度最大的复合膜组和纯PVA膜组，两组分别作为实验组和阴性实验组，按照国际标准组织(ISO/EN 10993-12)[8]规定提取浸提液。将灭菌后的上述两组样品分别浸泡于含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中，样品与培养基的比例为1 g/10 ml，24 h后获得浸提液。使用96孔板，NIH/3T3细胞播种，细胞密度为每孔1×104个，空白对照组细胞仅用培养基培养，阴性实验组和实验组细胞贴壁后分别更换为每孔100 μl的纯PVA膜和抗拉强度最大的复合膜浸提液，每组每个时间点5个复孔，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。在第1、4、7天，配置含10% CCK-8的DMEM，每孔加100 μl，37 ℃、5%CO2培养 2 h。用酶标仪在 450 nm 处读取吸光度(optical density, OD)值。

2 结果

2.1 各组膜抗拉强度的比较图2为各组薄膜样品应力-应变曲线及断裂应力值。在一定范围内，随着BC含量的增加，PVA-BC复合膜的抗拉强度也增加，当PVA与BC的质量分数比为10 ∶7时，复合膜的抗拉强度达到最大(155.5±14.7) MPa，显著高于纯PVA薄膜(56.0±6.7) MPa。随后继续增加BC的含量，抗拉强度开始下降，各组差异有统计学意义(F=67.239，P<0.001)；两两比较显示，纯PVA膜组与10 ∶3、10 ∶5、10 ∶7、10 ∶9 PVA-BC组组间差异均有统计学意义(P<0.05)，10 ∶7 PVA-BC组与10 ∶3、10 ∶5、10 ∶9 PVA-BC组组间差异均有统计学意义(P<0.05)，即当PVA与BC质量分数比为10 ∶7时，复合膜的抗拉强度最大。考虑到GBR膜实际使用为体内湿态环境，取干态抗拉强度最大的10 ∶7 PVA-BC膜组进行湿态下的力学测试。图2C、2D显示湿态下的复合膜强度达到(13.8±1.2) MPa。

图2 PVA-BC复合膜的抗拉强度测试A:各组样品的典型拉伸应力-应变曲线；B:各组样品的断裂应力值；与PVA组比较：#P<0.05；与10 ∶7组比较：*P<0.05；C：PVA-BC复合膜的典型拉伸应力-应变曲线干湿态对比；D：PVA-BC复合膜的断裂应力值干湿态对比

2.2 试件表征纯PVA薄膜和PVA-BC复合膜的横断面电镜下观察结果显示，PVA薄膜的断面光滑致密，几乎无孔(图3A、3B)，共混膜PVA-BC的横断面形貌略粗糙于纯PVA膜，厚度约为30 μm，BC的加入降低了材料的延展性，形成强韧的薄膜。结果表明，PVA薄膜加入BC后韧性和拉伸强度均有提高，未观察到团聚和宏观上的分离情况，表明薄膜中PVA和BC分散良好(图3C、3D)。XRD结果显示混合薄膜显示出多个衍射峰，分别为PVA的特征峰19°和BC的3个特征峰14°、16°和22°。图3F显示复合膜在3 410 cm-1处有1个宽阔的吸收峰，在 2 939 cm-1、1 424 cm-1、1 142 cm-1、1 093 cm-1和851 cm-1均存在吸收峰，表明复合膜与PVA结晶度相关。复合膜在3 400 cm-1、2 920 cm-1、1 643 cm-1及1 064 cm-1附近有明显吸收峰，表明所得产物具有纤维素的特征峰(图3E)。

图3 PVA-BC复合膜的微观结构和成分分析A、B：纯PVA薄膜截面；C、D：PVA-BC复合膜截面；E：PVA-BC复合膜的X射线衍射结果；F：PVA-BC复合膜的傅里叶变换红外光谱结果

2.3 细胞相容性实验结果CCK-8法检测结果显示，在共培养的第1、4、7天的相同时间点进行检测，NIH/3T3细胞在空白对照组、阴性实验组和实验组都保持了较高的增殖水平，相同时间点各组OD值差异均无统计学意义(P>0.05) ，见表1。说明PVA-BC薄膜具有良好的生物相容性。

表1 各组材料与NIH/3T3细胞共培养不同时间后的OD值比较

3 讨论

GBR技术中的屏障膜将快速增长的软组织与缓慢生长的骨组织分离开，以达到屏障的作用，最终达到牙槽骨组织的修复与再生的效果。目前使用的GBR膜可分为可吸收膜和不可吸收膜，不可吸收膜虽然具有更加稳定的机械性能以提供稳定的骨修复环境，但却需要二次手术取出，另外也存在术后暴露的问题，从而增加了患者的二次创伤及骨增量失败的风险[9]；可吸收膜由天然或合成材料制成，植骨术后一定时间(2周至几个月不等)完成吸收，无需二次手术取出，在一定时间内有效阻止了软组织进入骨修复区域，从而促进了新骨形成。但可吸收生物屏障膜存在机械强度不足的问题，这样不利于牙槽骨修复的效果，特别针对大面积骨缺损的修复重建(高度/宽度>5 mm)。

因此，本研究将PVA溶液和BC溶液以不同比例混合搅拌制备PVA-BC薄膜，旨在制备出新型可代谢高机械性能GBR膜。PVA本身具有高亲水性和优异的力学性能，无毒且溶于水，具有良好的可降解性，是一种生物相容性良好的水凝胶，具有生物医学应用所需的特性[10]。BC在生物材料领域有着广泛的应用，其具有生物相容性好、亲水性强、机械强度高、比表面积大等优点，已有多项研究[11-12]表明，向聚合物网络中引入BC可大大提高复合物的机械性能，可充当纳米复合材料的增强添加剂[13]。因此，本研究旨在制备一种基于PVA的复合材料，由PVA作为连续相，添加BC作为增强纳米材料，BC可通过广泛形成氢键与PVA聚合物基体发生强烈的相互作用，使PVA和BC纳米纤维表面形成牢固的界面，形成非常坚固的纳米复合材料[14]。完成制备后进行拉伸测试，当PVA与BC质量分数比为10 ∶7时，复合膜抗拉强度达到最大(155.5±14.7) MPa，此外，PVA和BC的高保水性使薄膜具有足够的柔韧性和湿润性，取该最强组，测试湿态下抗拉强度为(13.8±1.2) MPa，显著高于市售Bio-Gide胶原膜1.16 MPa[10]。因此，该复合膜在湿态情况下也具备一定强度。生物相容性实验表明PVA-BC膜具有良好的生物相容性。

综上所述，本研究通过溶液共混法制备出PVA-BC复合膜，并探索出最佳机械性能比例，对其结构、成分、形态进行表征，并进行生物相容性检测。结果表明，这种复合膜具有较高的机械性能，且生物相容性良好，具备成为GBR膜候选材料的潜力。下一步将通过体内大动物实验进一步明确其在牙槽骨缺损修复与再生中的作用。