数字全息波前聚焦算法在生物成像中应用

匡青云，赵志雄，杨 鸿

（1.重庆城市职业管理学院，重庆 400054；2.重庆机电职业技术大学，重庆 400054；3.重庆电子工程职业学院，重庆 400054）

引言

随着生物医学和生命科学的快速发展，定性、平面和非实时观测培养液中的生物细胞已经不能满足现代化研究需求。为了观察细胞的结构形态、生理参数、药物对细胞的作用机理及细胞间相互作用等动态特性，对观测提出了定量、三维和实时响应的要求。数字全息术是把全息图记录下来后储存于电脑中，利用光电子元件CCD(或CMOS)作为介质，利用衍射传播理论对目标的光波复原及传输进行仿真。物光波传输经过不同折射率或厚度不同的目标物体或目标物体受到温度变化等环境影响发生热物理性质改变时，它的实际距离是难以精确测量的。在数字全息重现过程中，重现距离直接受到真实记录距离的影响，当重现距离与真实记录距离出现较大偏差时，物体的重现就像是模糊不清，信噪比降低，观测精度下降。数字全息运用菲涅尔- 基尔霍夫衍射理论数字重建物体波前[1]，该数值化过程可采用聚焦函数和聚焦算法来确定最佳再现距离，使最佳聚焦位置处的再现像清晰，信噪比提升，有利于高精度测量。

目前，聚焦算法中广泛运用物体波前的振幅信息[2-3]。沿光轴重建出的一系列再现像，聚焦函数在最大或最小值等函数特征点时再现像锐利度最高，最清晰。常用熵[4]，方差[5]，频谱[3]以及使用相关系数法作为聚焦函数的评价参数来确定重建像的最佳聚焦位置。

在介绍全息理论基础之上，作为聚焦算法获得最佳聚焦位置的基本原理，分析利用物体振幅信息的相关系数法。介绍物体相位信息的相关系数法，在对缠绕相位信息进行解包处理后，作为判别焦平面过程的聚焦算法。将含有尺寸大小不同的圆形颗粒标准靶面作为目标物体分析从物体振幅和相位信息聚焦算法中所得最佳聚焦距离的加权结果对比结果。将洋葱表皮生物细胞标本为目标观测物体，分析不同聚焦算法即振幅信息的聚焦算法，相位信息的聚焦算法，波前信息的聚焦算法所得重建像锐利度，观测生物细胞标本的三维形貌。

1 基本原理

1.1 相关系数法的基本原理

相关系数法（CC）计算以该平面为中心光轴左右对称两侧重建像的相似程度作为评价参量，相关系数法（CC）计算以该平面为中心光轴左右对称两侧重建像的相似程度作为评价参量，在CC 值为1，代表两个平面形象完全相似，该目标的中心面为最优的重构造。在0 时，通过对某一步骤的步长分析，进一步计算出目标平面，而目标平面左右对称平面没有相似性，无法确定最优聚焦位置。将光轴切片地重建物体的强度重构象沿着∆z 固定步长，∆CZ/2 为左右对称平面与中心平面之间的距离，并利用该相关因子的峰值来判定焦平面的位置在光轴上的重构象对称的两面图像之间的关联性。

在CC 值为1，代表两个平面形象完全相似，该目标的中心面为最优的重构造。在0 时，通过对某一步骤的步长分析，进一步计算出目标平面，而目标平面左右对称平面没有相似性，无法确定最优聚焦位置。将光轴切片地重建物体的强度重构象沿着∆z 固定步长，∆CZ/2 为左右对称平面与中心平面之间的距离，并利用该相关因子的峰值来判定焦平面的位置在光轴上的重构象对称的两面图像之间的关联性。

1.2 振幅和相位的焦平面方法

利用测量方法可以大致测量出目标的记录距离，但是由于光相干成像技术的传输特性和目标对象的动力学特性，导致了目标的热物理性质会引起目标的表面变形或位移，当外部因素的影响时，目标的热物理性质就无法精确地测量出实时光学系统中目标的记录距离。复建离焦图像模糊物体信息不失去，复建图像清晰物体焦平面在理想状态下不失去。合理的自动聚焦算法在数字全息的数字化重建过程中通过聚焦函数准确判断最佳焦平面位置，在高精度测定中，例如MEMS 故障检测等具有重要意义。物体波前表示为E（x，y）=a（x，y）exp[iφ（x，y）]，a（x，y）为物体振幅信息，φ（x，y）为物体相位信息，a（x，y）或φ（x，y）只是物体波前信息中的某部分信息，将a（x，y）和φ（x，y）同时运用于聚焦算法中，准确确定再现距离，提高焦平面定位精度。

物体波前的相位信息被包裹在2π 中，当物体的相位信息大于一个波长时。通过对解包裹后的相位信息进行计算，可以得到目标的相位信息，这是由于相位解包裹方法的发展而产生的。采用相关系数方法，采用解包后的相位信息作为评估参数，能够准确地判定目标的焦平面最优的位置。通过理论和试验，证明了该聚焦算法在焦平面上的最大聚焦函数曲线中，得到的曲线呈现出对称的分布，两侧对称图像的相似性较高或一致。沿着光轴分析目标物体重建像，得到用相位信息作为参量的相关系数法聚焦函数曲线，最高峰值处为最佳聚焦位置。

利用波长632.8 nm 激光，CCD 分辨率2 048×2 048，7.4 um×7.4 um，以不同尺寸各颗粒径标准靶面上为观察对象来验证相位信息运用于聚焦算法的可行性，并对比分析振幅聚焦函数，相位聚焦函数，波前信息聚焦函数。靶面图像及相应的全息图见图1。将振幅信息和相位信息运用于相关系数法聚焦函数，函数曲线及对应峰值重建像见图2。振幅信息和相位信息的聚焦函数峰值确定的最佳聚焦位置为181.47 mm和181.20 mm。运用线性加权原理，将振幅信息和相位信息加权作为定焦算子，最终得到的最佳重建位置为181.335 mm。加权后的最佳聚焦位置同时将物体振幅和位相作为聚焦参量，完成物体波前信息作为参量的聚焦。

图1

图2

2 实验过程

通过波长632.8 nm 激光，CCD 分辨率36642748，像元大小1.67 um×1.67 um 为实验仪器，洋葱表皮细胞制成的生物标本为观测对象，建立了数字化全息成像体系，并对其进行了试验和分析。洋葱表皮细胞因生长周期不同而不同，且受到外界环境影响，一般为微米量级。在洋葱表皮细胞成像后，利用有关系数聚焦曲线和重建强度，对其幅度和解包裹相位进行了分析。振幅和相位曲线峰值确定的最佳重建位置为151.25 mm 和152.95 mm，物体波前信息判定的最佳重建位置为152.1 mm。位相分布图及位相局部分布放大图分别见图3 和图4。

图3 不同重建方法位相分布结果

图4 放大图

3 结论

振幅，相位和波前聚焦算法的洋葱表皮细胞强度重建像中，相位聚焦确定的最佳聚焦位置边缘处对比清晰，振幅确定的焦平面边缘较相位模糊，但表皮细胞的重建像相对清晰。波前信息重建结果较好，对比度高。洋葱表皮细胞相位重建结果进行分布，将相位信息作为聚焦算法参量的分布，边缘锐化明显，明显区别于载玻片，但是在表皮边缘内部的细胞则锐利度不高与背景的区分不明显。观察振幅信息作为聚焦算法参量的位相分布，表皮区域内细胞清晰度高形态可见，但是表皮周边细胞模糊，形态不明显。同时物体振幅和相位即目标物体整体波前信息作为聚焦算法参量的位相分布放大图，表皮边缘细胞清晰度高于运用振幅信息作参量进行聚焦重建像，且表皮内部的细胞形貌清晰可见，优于将相位信息作为参量的聚焦重建像。从目标观测物体的强度和位相分布中的对比分析，将物体振幅和相位作为相关系数法聚焦参量的聚焦算法具有优越性，能提高单一聚焦参量的聚焦算法最佳重建像的质量。