新疆地区GIII.2型牛诺如病毒流行病学调查及ORF1基因遗传进化分析

马志刚，何 琴，施晨阳，刘馨博，郭雪萍，吴 静，马英才，苏战强，钟 旗，姚 刚，马雪连*

（1.新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆 乌鲁木齐 830052）

牛诺如病毒（Bovine norovirus，BNoV）属于杯状病毒科，为无包膜单股正链RNA 病毒，呈20 面体结构，直径为27 nm～40 nm。BNoV 常感染犊牛，使其出现非出血性肠炎、吸附不良性腹泻、食欲下降及木糖吸收不良等临床症状，并伴有肠道病变，如萎缩性空肠炎，最终造成犊牛死亡[1]。目前GenBank中有5 个NoV 基因型，BNoV 属GIII 型，其有GIII.1、GIII.2 和GIII.3 等3 个基因型，该病毒基因组中有3个阅读框（Open reading frame，ORF），其中ORF1 编码P48、NTPase、P22、VPg、Pro 和RdRp，均为非结构蛋白[2]；ORF2 编码主要衣壳蛋白，为VP1 结构蛋白，VP1 又包含两个主要的结构域：一个是保守的S 结构域，另一个是更具可变性的P 结构域；ORF3 编码次要结构蛋白VP2，它在BNoV 病毒颗粒中起着稳定作用[3]。目前研究发现，该病毒的基因重组多发生在ORF1 和ORF2。

目前在新疆地区关于BNoV 的研究较少，仅2020 年报道在87 份新疆地区的犊牛腹泻样品中检测出6 个阳性，阳性率为6.9%[4]，暂时未见新疆地区BNoV 的全基因组序列的研究。为了进一步完善新疆地区BNoV 的基因型研究，本研究采用RT-PCR 方法对新疆部分地区开展了BNoV 感染的调查，并且对其ORF1 基因进行遗传进化和基因重组分析，填补了新疆地区对BNoV 基因序列研究的空白，为新疆地区BNoV 感染的防制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料TRIzol 购自Invitrogen，Hifair®III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（gDNA digester plus）、MolPure®Plasmid Mini Kit 购自翌圣生物科技（上海）有限公司；2×TaqPCR Mix、Universal DNA Purification Kit、DH5α 感受态细胞均购自天根生化科技（北京）有限公司；pGEM®-T Easy Vector System I 购自Promega公司。

1.2 样品来源及处理230 份3 月龄犊牛粪便样品为2020 年7 月至2021 年6 月分别采自新疆乌鲁木齐、塔城、伊犁、喀什地区的牛场。将粪便样品按1∶3 的比例用1×PBS溶液稀释混匀后于-20 ℃反复冻融3次备用。

1.3 BNoV 流行病学调查参照GenBank 登录的BNoV 序列的RdRp 基因序列（MN480761.1），利用Primer 5.0设计引物：5′-ATCTCGCACGATGCCAAG-3′/5′-GTCATCTTCATTTACAAAATCGG-3′，扩增产物长度为342 bp，引物由上海生物工程有限公司合成。采用TRIzol 试剂/氯仿分层法提取1.2 中粪便样品RNA，利用Hifair®III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（gDNA digester plus）将其反转录为cDNA，以其为模板，采用上述引物，利用PCR 方法检测粪便样品中BNoV，对检测结果根据区域因素分析新疆地区犊牛BNoV的感染情况。

1.4 BNoV ORF1 基因的PCR 扩增参照GenBank中BNoV 序 列 的ORF1 基 因（MN480761.1），利 用Primer 5.0 设计引物（表1），引物由上海生物工程有限公司合成。选取塔城地区两份阳性样品，按照1.3中方法获得模板后，利用表1 中引物分段扩增ORF1全基因序列，扩增产物由上海生物工程有限公司测序后，对测序结果使用SeqMan 5.08 拼接获得ORF1全基因序列。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.5 BNoV ORF1 基因序列分析参考NCBI 中20株NoV 各型ORF1 基因组序列，使用Clustal W 对获得的ORF1 全基因序列比对，然后采用MEGA 7.0 软件，neighbour-joining 法，Bootstrap method 1000 构 建进化树；利用DNAStar 软件中的MegAlign 对该ORF1基因序列与国内外的ORF1 基因序列分别进行核苷酸及氨基酸序列的同源性分析；利用Simplot 分析该ORF1重组情况。

2 结果与讨论

2.1 BNoV 流行病学调查结果由于RdRp 基因是BNoV 遗传与进化的重要基因之一[5]，该基因较短，更易获得，所以常常被作为检测BNoV 时的靶基因。本研究以RdRp 基因保守区为目的片段，利用RT-PCR 技术对新疆4 个地区7 个牛场的230 份3 月龄犊牛粪便样品进行BNoV 流行情况检测，结果显示新疆地区230 份样品中共检测出41 份BNoV 阳性样品，阳性率为17.83%（41/230），部分粪便样品的PCR 检测结果见图1。其中乌鲁木齐地区阳性率0.26%（1/38），塔城地区阳性率60.00%（9/15），伊犁地区阳性率3.51%（2/57），喀什地区阳性率24.16%（29/120）。结果表明BNoV 在新疆地区广泛存在，且流行情况存在区域差异。犊牛BNoV 感染一方面与犊牛自身免疫力不足以及环境气候恶劣有关，另一方面与养殖场饲养管理不当也有一定关系[6]，包括犊牛初乳饲喂不及时、抗寒措施不到位、疫病隔离不合理等[7]。本研究采样时发现塔城以及喀什地区牛场多建立在沙漠地带，存在自然环境差，水资源缺乏，水质差（硫含量较高），犊牛舍环境不达标，消杀程序不完善，新生犊牛初乳摄入量不足等问题，这些可能是造成这些区域BNoV 检出阳性率偏高的原因。而乌鲁木齐、伊犁均属于北疆地区，北疆环境相对于南疆更加适合养牛业的发展，且北疆地区兽医及养殖人员专业化程度更高，因此这些地区BNoV 的检出率低。

图1 部分样品的PCR检测结果Fig.1 PCR detection results of some samples

BNoV 流行较广，相继在比利时[8]、英国[9]、美国俄亥俄州[10]、韩国[11]、土耳其[12]、法国[13]等全球多个国家检出。在国内多个地区也已检出BNoV，且阳性率较高。师志海在2018年河南省8个腹泻样品中检测出2 份阳性，阳性率为25%[14]。王玥琳在2017 年～2018年对国内5 个省的BNoV 检出率分别是四川34.78%（8/23）、辽宁75.00%（12/16）、河南11.11%（3/27）、山东9.09%（1/11）和陕西0（0/16）[15]。王文佳于2017 年到2019 年对河南省BNoV 的检出率为9.96%（20/221）[16]。而新疆地区直到2020 年王玥琳在87 份犊牛腹泻样品中检测出6 个阳性，阳性率为6.9%，证实了BNoV在新疆地区的存在[2]。本实验对新疆地区流行病学调查结果也进一步说明BNoV 具有广泛的地区流行特征，且新疆多地犊牛感染了该病毒。

2.2 BNoV ORF1 基因的PCR 扩增及序列分析结果选取塔城两个BNoV 阳性样品，分别分段扩增BNoV ORF1 基因片段（图2），经拼接后ORF1 基因长度均为5 055 bp。分别命名为Bo/XJ-TC/2020/China（Gen-Bank： OK254099）和Bo/XJ- TC- 2/2021/China（Gen-Bank：OL304917）。

图2 ORF1基因的分段扩增结果Fig.2 Results of BNoV ORF1 gene amplification

分别与GenBank 中的20 株NoV ORF1 基因进行核苷酸序列对比，并构建进化树，结果显示，检测到的Bo/XJ-TC/2020/China 和Bo/XJ-TC-2/2021/China BNoV 与中国四川地区OK32546.1 病毒株位于一个分支（图3A）；进一步与GenBank中14株BNoV GIII ORF1基因构建进化树，结果显示，本实验检测到的Bo/XJTC/2020/China 和Bo/XJ-TC-2/2021/China 均属于GIII.2型BNoV（图3B）。

图3 BNoV GIII型遗传进化树Fig.3 Phylogenetic tree of NoV(A)and BNoV GIII type(B)

上述结果表明新疆塔城地区BNoV 与国内不同地区的GIII.2 型BNoV 均为同一进化簇，是源于同一株BNoV 进化而来，并且与国内BNoV 的相似性较高，与国外BNoV 的相似性较低。

对比国内外几株GIII.2 型BNoV ORF1 基因序列，结果显示Bo/XJ-TC/2020/China 和Bo/XJ-TC-2/2021/China ORF1 基因序列的同源性为100%；与中国四川地区OK032546 病毒株相应基因序列同源性最高，为99.6%；与中国江苏地区MW810336 病毒株同源性最低，为82.8%，与国外其他几株的核苷酸同源性为91.3%～96.4%。Bo/XJ-TC/2020/China 和Bo/XJ-TC-2/2021/China ORF1 编码氨基酸序列之间的同源性为99.9%；与中国河北地区MZ573197 病毒株相应氨基酸序列同源性最高，为98.3%；与中国江苏地区MW810336 病毒株相应氨基酸序列同源性最低，为76.1%；与国外其他几株的相应氨基酸序列同源性为96.6%～98.3%。表明塔城地区BNoV 和其他GIII.2 型BNoV 源于同一株BNoV 进化而来，该BNoV的变异程度较低。

近年来韩国[17]，乌拉圭[18]等国相继检测到了BNoV GIII.2 型，师志海等人在2018 年检测到BNoV GIII.2型[14]。本实验中的2株BNoV的ORF1基因遗传进化分析结果也显示均为GIII.2 型，可见BNoV GIII.2 型目前已呈现全球广泛流行。

2.3 BNoV ORF1 基因重组分析结果对本实验检测到的BNoV ORF1 基因进行基因重组分析，结果显示其与挪威、英国和比利时报道的GIII.2 型病毒株ORF1 基因中未出现基因重组现象。表明本研究检测到的BNoV 在ORF1 基因中无基因重组现象发生。王文佳等人在2020年报道了BNoV VP1（即为ORF2）基因和ORF1-ORF2 连接处预测到了基因重组现象[16]。在2020 年也报道了BNoV 基因重组现象的发生，且基因重组位点也发生在ORF1-ORF2 连接处[18]。说明BNoV基因变异的情况多发生在ORF1-ORF2 连接处，应对BNoV 该区域基因序列重点关注，并预测优势的抗原表位，为疫苗的研制提供更多理论依据。

本研究结果表明BNoV 在新疆地区的感染率较高，且在多个地区流行，并首次报告了新疆地区BNoV 与国内外BNoV 在ORF1 基因无重组现象。