新疆部分地区马疱疹病毒2型gB基因遗传变异分析

帕丽旦·努尔兰，邓海峰，段汝丽，贾陈阳，杨恩惠，田澍瑶，潘娟娟，况 玲，佟盼盼*，谢金鑫*

（1.新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.伊犁哈萨克自治州昭苏马场，新疆 昭苏 835602）

疱疹病毒（Herpesvirus）属于疱疹病毒科（Herpesviridae），是有囊膜的双链DNA 病毒，可感染人类和其他脊椎动物[1]，并在宿主体内建立持续性感染。根据序列同源性和基因组结构，疱疹病毒分为3 个家族（α、β 和γ），已报道能感染马属动物的疱疹病毒（Equid herpesvirus，EHV）有9 种，即EHV-1～EHV-9，属于α 疱疹病毒亚科的有EHV-1、EHV-3、EHV-4、EHV-6、EHV-8 和EHV-9，属于γ 疱疹病毒亚科的有EHV-2、EHV-5 和EHV-7[2]。其中EHV-2 又称马细胞巨化病毒，感染马后可导致流产、呼吸系统疾病、角膜结膜炎和共济失调等症状[3-7]。目前，国内仅有EHV-2 引起马驹呼吸道疾病的相关报道[8]，但尚未在马流产样品中检测到该病毒。

囊膜糖蛋白B（Envelope glycoprotein B，gB）对EHV的复制至关重要，并在病毒进入细胞中发挥重要作用，常用于病毒鉴定和遗传变异分析[9]。本研究首次在国内马流产胎儿肺脏组织样品中检测到EHV-2，并对其gB 基因进行了遗传进化分析，为EHV-2 的流行病学研究提供了基础数据。

1 材料与方法

1.1 样 品2021年1月，本实验室从新疆伊犁昭苏县6个规模化马场及周边散养户采集93份马匹流产胎儿的肺脏组织，冷链运输至实验室储存于-80 ℃备用。

1.2 主要试剂病毒DNA 提取试剂盒和胶回收试剂盒购自Geneaid 公司；DL2000 DNA Marker 购自TaKa-Ra 公司；2×TransStart®FastPfu Fly PCR SuperMix 购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 引物设计与合成参考GenBank 中EHV-2 G9/92 株（KM924294）的gB 基因序列，利用Primer 5.0 软件设计gB 基因特异性引物：5′-GGTGACACTATAG AGATGTCRCC-3′/5′-CTGTTGATGCTCTTTCTGAGATT G-3′，引物由派森诺生物科技股份有限公司青岛合成部合成。

1.4 EHV-2 gB基因的扩增和序列分析每份肺组织样品取约0.5 g，按1∶10（w/v）加入无菌1×PBS 缓冲液低温震荡研磨后，于4 ℃、12 000 g 离心5 min，取200 μL 上清液，利用病毒DNA 提取试剂盒分别提取各样本中DNA 作为模板，利用1.3 中引物扩增gB 基因，反应条件：94 ℃2 min；94 ℃20 s、50 ℃20 s、72 ℃30 s，共35个循环，72 ℃5 min，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。采用DNAStar软件对gB基因进行序列比对及分析，利用MEGA7.0.26 软件采用最大似然法（Maximum Likelihood methods）构建gB氨基酸序列系统进化树，步展值重复1 000次进行评估。

2 结果与讨论

2.1 EHV-2 PCR 检测利用gB 基因特异性引物对93份肺组织样品进行PCR 扩增，结果显示，在3份样品中扩增到716 bp 的目的片段（图1），与预期EHV-2的gB 基因片段相符；进一步测序结果显示，也均与EHV-2 gB 参考基因序列一致。EHV-2 的阳性率为3.2%（3/93）。将3 株EHV-2 gB 基因序列上传至Gen-Bank，获得登录号为OK362329-OK362331，并将这3个gB 基因所在病毒分别命名为XJ-YLZS24，XJ-YLZS28，XJ-YLZS30。已有报道显示，EHV-2是导致马流产的重要病原[7]，本研究在国内首次从马早期流产胎儿样品中检测到EHV-2，提示该病毒可能主要危害孕早期马。另外，张磊等报道EHV-2引起乌鲁木齐汗血马马驹呼吸道疾病[8]，表明EHV-2 可导致新疆地区马不同的临床症状。

图1 马流产胎儿肺组织样品EHV-2 gB基因的PCR扩增结果Fig.1 PCR detection of EHV-2 gB gene in aborted fetal lung tissues

2.2 EHV-2 gB 基因同源性分析利用MegAlign 软件对gB 基因分析，结果显示，本研究鉴定的3 株EHV-2之间gB基因序列和氨基酸序列的同源性分别为99.9%～100%和99.6%～100%。且该3株EHV-2 gB基因序列和氨基酸序列与澳大利亚（Aus-9 株）、巴西（EHV2-RS1 株）、德国（Ger-8 和Ger-5 株）、冰岛（Bj株）、波兰（PL_EHV2_3_I、PL_EHV2_27_V、PL_EHV2_42_IX、PL_EHV2_55_XIII 和PL_EHV2_48_X 株）、瑞士（275株）、英国（Eng-2、Eng-3和Eng-13株）和中国（CJ-31-06 和CJ-07 株）EHV-2 gB 基因和氨基酸序列同源性分别为91.6%～96.4%和90.8%～96.2%，表明EHV-2 gB基因具有遗传变异多样性。

利用CLC Sequence Veiwer 8.0 软件分析本研究鉴定的3 株EHV-2 gB 氨基酸序列和16 株EHV-2 参考株的gB 氨基酸序列，结果显示，本研究鉴定的3 株EHV-2 gB氨基酸序列均有一些位点发生了突变，且主要位于其羧基端（图2），与EHV-2新疆参考株CJ-31-06 和CJ-07 gB 氨基酸序列相比有12 个位点发生突变，分 别 为V162I、 S194P、 R195K、 R197K、 S200D、 A201T、G204V、G208N、G210E、E211G、E212A、N214Y；与其他参考株gB氨基酸序列相比有26个位点发生突变（图2），表明本研究鉴定的3株病毒（XJ-YLZS24、XJ-YLZS28和XJ-YLZS30）为新的EHV-2 变异株。Holloway 等报道EHV-2 gB 抗原表位在其氨基端[10]，本研究鉴定的EHV-2 gB氨基酸突变主要位于羧基端，这些氨基酸突变是否与病毒侵入和在细胞间传播及免疫逃逸相关，需要进一步研究证实。

图2 EHV-2 gB蛋白氨基酸残基变异情况Fig.2 Variations of amino acid residues in gB protein of EHV-2

2.3 EHV-2 gB 氨基酸序列遗传进化树分析以英国、德国、波兰和我国等发现的16 株EHV-2 为参考株，利用MEGA7.0.26软件构建gB氨基酸进化树，结果显示鉴定的3株EHV-2形成独立进化分支，且与分离于波兰（PL_EHV2_42_IX、PL_EHV2_3_I 和PL_EHV2_3_I）、英国（Eng-2 和Eng-3 株）以及瑞士（275 株）亲缘关系较近，而与本实验室在马呼吸道疾病样品中发现的EHV-2（CJ-31-06和CJ-07株）处于不同分支[8]（图3），表明新疆地区有两种EHV-2 在马群中流行，可分别引起马流产和呼吸道疾病。CJ-31-06 和CJ-07株来源于国外引进的汗血马，而本研究鉴定的XJ-YLZS24、XJ-YLZS28 和XJ-YLZS30 来源于新疆伊犁马，表明这3 株EHV-2 可能在伊犁马中独立循环。值得注意的是，EHV-2 gB 易发生突变，因此需进一步调查新疆地区马中流行的优势EHV-2，为疫苗开发奠定基础。

图3 EHV-2 gB氨基酸序列的遗传进化树Fig.3 Phylogenetic analysis of EHV-2 gB amino acid sequence

流产是阻碍马产业健康发展的重要因素之一，在美国、日本和欧洲等马产业发达国家，马流产率为12.2%～20.2%[11-12]，本研究结果显示伊犁马流产率约为23%。目前已知引起马流产的病毒有EHV-1、EHV-2、EHV-4、EHV-5、EHV-8、马动脉炎病毒（EAV）、牛痘病毒（CPXV）、布尼亚维拉病毒（BUNV）和西尼罗病毒（WNV）[13-17]。在我国仅有EHV-1 引起马流产的报道[18-20]，本实验室将进一步收集新疆地区伊犁马及其他品种马的流产样品，深入研究以明确EHV-2在新疆地区马流产样品中的流行趋势和特征，为防控EHV-2导致的马流产奠定基础。