鸭腺病毒B血清1型和血清2型双重PCR检测方法的建立及应用

江丹丹，林 昶，黄志坚，肖世峰，王 劭，林锋强，程晓霞，朱小丽，陈秀琴，董 慧，陈少莺*，陈仕龙*

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建 福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建 福州 350013；3.福建农林大学动物科学学院（蜂学学院），福建 福州 350002；4.三明市绿色食品发展中心，福建 三明 365000）

禽腺病毒（Fowl adenovirus，FAdV）是一种危害家禽的常见病原，可以引起禽类发生多种疾病，如包涵体肝炎、肝炎-心包积液综合征和肌胃糜烂等，对家禽养殖业造成较大的经济损失[1-3]。

番鸭腺病毒（Duck adenovirus，DAdV）GR 株最早是法国于1977 年分离自临床表现为消瘦、跛行、急性死亡的30 多日龄雏番鸭[4]，2014 年国际病毒分类委员会（The International committee on taxonomy of viruses，ICTV）将GR 株列入DAdV 禽腺病毒属鸭腺病毒B 种[5]。2014 年以来，我国广东、福建等省部分番鸭饲养区雏番鸭流行一种以急性死亡，肝脏肿大、颜色变淡呈黄白色、表面有斑驳状或弥漫性出血点，肾脏肿大、出血等为临床特征的疫病，其病原是一种与DAdV-B GR 株亲缘关系最近的鸭腺病毒[6-9]。根据国内外番鸭腺病毒分离株的基因序列特征及血清交叉中和活性，结合ICTV 对FAdV 的分类标准，将法国GR株和我国番鸭白肝病腺病毒分离株均归入禽腺病毒属鸭腺病毒B 种，分属为GR 血清1 型或基因1 型（DAdV-B1）、血清2型或基因2型（DAdV-B2）[10]。

国内是否存在DAdV-B1 感染尚未见报道，但开展DAdV-B1 感染的流行病学调查对防止该病原的传入和防制措施的制定尤为关键。DAdV-B1 和DAdVB2 全基因组之间同源性在90%以上，但由于DAdVB2 含有两个fiber 基因，而DAdV-B1 仅有一个fiber 基因，且与DAdV-B2 的fiber1 和fiber2 基因序列同源性分别为26.7%和30.92%，与禽腺病毒属其他病毒株fiber 基因的同源性更低，而目前国内外还未报道鉴别DAdV-B1 和DAdV-B2 的双重PCR 检测方法。因此本研究基于DAdV-B1 fiber 基因和DAdV-B2 fiber1 基因，建立了特异性鉴别检测DAdV-B1 和DAdV-B2 的PCR 方法，为该病防控提供了检测手段。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料DAdV-B2 分离株BG61（105.0TCID50/0.1 mL）、鸭腺病毒A 型（DAdV-A）、禽腺病毒血清4 型（FAdV-4）、番鸭呼肠孤病毒（MDRV）、新型呼肠孤病毒（NDRV）、番鸭源鹅细小病毒（MDGPV）、番鸭细小病毒（MDPV）、禽坦布苏病毒（ATUMV）等、以及阴性对照鸭胚胎成纤维细胞（Muscovy duck embryo fibroblast，MDEF）均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所动物病毒室分离制备与保存。GR 株fiber 基因由北京擎科生物科技有限公司合成。病毒核酸提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒和反转录试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；pMD18-T载体、DL2000 DNA Marker均购自TaKaRa 公司；2×PCR Mix 购自Thermo Scientific 公司。

1.2 引物的设计与合成根据DAdV-B1 GR 株（KJ469653）fiber 基因和DAdV-B2 CH-GD-12-2014 株（KR135164）及BGGTL 株（MN551586）fiber1 基因序列，利用Premier 5. 0 软件设计2 对特异性引物，分别扩增DAdV-B1 fiber及DAdV-B2 fiber1，引物序列见表1，引物由福州尚亚生物技术有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.3 DAdV-B1 fiber、DAdV-B2 fiber1质粒标准品的制备分别以GR fiber 基因、DAdV-B2 分离株BG61的基因组DNA为模板，采用表1中引物分别PCR 扩增DAdV-B1 fiber 和DAdV-B2 fiber1，反应体系为：2×PCR Mix 25 μL，基因组DNA 2 μL，上下游引物各1 μL（10 μmol/L），灭菌去离子水补至终体积50 μL。单一PCR 反应程序中DAdV-B1 fiber 退火温度为60.9 ℃，DAdV-B2 fiber1 退火温度59.9 ℃。PCR 产物纯化后克隆至pMD18-T 载体，分别构建重组质粒标准品p-DAdV-B1-fiber 和p-DAdV-B2-fiber1，重组质粒经PCR 鉴定后，由福州尚亚生物技术有限公司测序。利用分光光度仪测定该标准品浓度，通过转换公式（拷贝数/μL=（6.02×1023）×（浓度（ng/μL）×10-9）/（碱基数×660））换算为拷贝数。

1.4 双重PCR 方法的建立及反应条件的优化双重PCR 初步反应体系为：2×PCR Mix 25 μL，重组质粒标准品各1 μL，混合引物2 μL，补充灭菌去离子水至终体积50 μL。双重PCR 反应程序为95 ℃3min；95 ℃30 s、60.4 ℃30 s、72 ℃1 min，30个循环；72 ℃5 min。在此基础上，采用方阵法对双重PCR 方法的退火温度（57 ℃～65 ℃）、DAdV-B1 fiber 引物浓度（0.02 μmol/L～0.2 μmol/L）和DAdV-B2 fiber1 引物浓度（0.02 μmol/L～0.2 μmol/L）进行优化，确定双重PCR方法最佳退火温度和引物浓度。

1.5 双重PCR 方法的特异性试验利用病毒核酸提取试剂盒提取DAdV-B2分离株及其他常见鸭源病原DAdV-A、FAdV-4、MDPV、MDGPV、MDRV、NDRV、ATUMV 的核酸，其中MDRV、NDRV、ATUMV 采用反转录试剂盒获得cDNA；利用细胞总DNA 提取试剂盒提取MDEFs细胞的DNA、利用质粒小提试剂盒提取DAdV-B1-fiber、DAdV-B2-fiber1 质粒和pMD18-T 空载体，分别以上述基因组及质粒为模板，按照优化后的反应条件进行PCR扩增，评价建立方法的特异性。

1.6 双重PCR 方法的敏感性试验将p-DAdV-B1-fiber 和p-DAdV-B2-fibr1重组质粒等体积混合后作10倍倍比稀释（105～1010），利用已优化的双重PCR方法扩增，评估该方法对质粒标准的敏感性。另外，将DAdV-B2 分离株BG61 稀释成1×105TCID50/0.1 mL、1×104TCID50/0.1 mL、1×103TCID50/0.1 mL、750 TCID50/0.1 mL、500 TCID50/0.1 mL、250 TCID50/0.1 mL、125 TCID50/0.1 mL、50 TCID50/0.1 mL、25 TCID50/0.1 mL、10 TCID50/0.1 mL、1 TCID50/0.1 mL，提取各滴度病毒的核酸，分别利用本研究建立的方法及文献[11]中的fiber2 PCR 方法（扩增片段大小为548 bp），对DAdV-B2 病毒滴度进行敏感性检测。

1.7 双重PCR方法的重复性试验分别以105倍稀释的重组质粒标准品p-DAdV-B1-fiber 和p-DAdV-B2-fiber1为模板，采用本实验建立的方法进行检测，平行做4次重复；不同时间提取105倍稀释的重组质粒标准品p-DAdV-B1-fiber 和p-DAdV-B2-fiber1为模板，采用本实验建立的方法进行检测，平行做4 次重复。计算上述批内批间检测结果符合率。

1.8 临床样品检测取临床疑似DAdV 感染的病死番鸭组织样品64 份，液氮研磨后采用灭菌Hanks 液重悬制成30%匀浆，利用病毒DNA/RNA 提取试剂盒提取病毒DNA 为模板，利用1.3 中的DAdV-B1-fiber、DAdV-B2-fiber1 单一PCR 及本实验建立的双重PCR分别检测，随机挑选取部分扩增产物送福州尚亚生物技术有限公司进行测序分析，统计检测结果并计算二者的符合率。

2 结 果

2.1 单一PCR 的扩增及重组质粒的构建与鉴定结果分别以DAdV-B2 分离株BG61 的基因组DNA 和GR fiber 合成序列为模板，采用对应引物，分别PCR扩增。结果显示，扩增产物分别为581 bp 和188 bp（图1），与预期目的片段大小相符。将上述2 条目的片段克隆至pMD18-T 载体构建相应重组质粒并测序，测序结果显示2 条目的片段序列与相应参考基因的序列同源性均为100%，并正确插入pMD18-T载体。表明正确构建重组质粒p-DAdV-B1-fiber 和p-DAdV-B2-fiber1。

图1 DAdV-B1 fiber和DAdV-B2 fiber1基因的PCR 扩增结果Fig.1 PCR amplification results of DAdV-B1 fiber andDAdV-B2 fiber1

2.2 双重PCR 方法的建立及反应条件的优化以p-DAdV-B1-fiber 和p-DAdV-B2-fiber1 重 组 质 粒 为模板，利用双重PCR 进行扩增。结果显示，在同一反应体系中，2 对引物均能特异地扩增出相应的目的片段。在此基础上，进一步对双重PCR的退火温度和引物浓度进行优化。结果显示，当退火温度为57 ℃～65 ℃时，该双重PCR 的扩增效果均较好；当DAdVB1 fiber和DAdV-B2 fiber1引物终浓度均为0.16 μmol/L时双重PCR 扩增效果最好。因此，确定该双重PCR的最佳退火温度为60.1 ℃，DAdV-B1 fiber F/R 和DAdV-B2 fiber1 F/R 引物最佳浓度均为0.16 μmol/L。

2.3 双重PCR 方法的特异性试验结果利用建立的双重PCR 对鸭临床常见病原检测，结果显示该方法能同时特异地扩增出DAdV-B1 fiber 和DAdV-B2 fiber1 基因片段，而对其他常见鸭源病毒DAdV-A、FAdV-4、MDRV、NDRV、MDGPV、MDPV、ATUMV和阴性对照扩增均为阴性（图2）。结果表明，该双重PCR 方法特异性较强。

图2 双重PCR方法的特异性试验结果Fig.2 Specificity analysis of the duplex PCR assay

2.4 双重PCR 方法的敏感性试验结果将p-DAdV-B1-fiber 和p-DAdV-B2-fibr1 重组质粒等体积混合并作10 倍倍比稀释后进行双重PCR 检测。结果显示，该双重PCR 对DAdV-B1 fiber 的最低检测限为175 拷贝/μL，对DAdV-B2 fiber1 的最低检测限为163 拷贝/μL；另外利用本研究建立的双重PCR 方法和文献[11]中方法检测不同滴度的DAdV-B2 BG61株，结果显示该方法最低检出滴度为1×101TCID50/0.1 mL，而利用文献[11]中PCR 方法检测的最低滴度为2.5×101TCID50/0.1 mL（图3）。表明该双重PCR 方法敏感性较高。

图3 双重PCR方法的敏感性试验结果Fig. 3 The sensitivity test results of the duplex PCR assay

2.5 双重PCR 方法的重复性试验结果利用建立的双重PCR方法分别进行批内和批间重复性试验，结果显示，批内和批间重复性试验结果均一致（图4），表明该双重PCR 重复性较好。

图4 双重PCR的重复性试验Fig.4 Repeatability assay of the duplex PCR assay

2.6 临床样品的检测结果利用本研究建立的双重PCR 及各自的单一PCR 方法，对64 份临床疑似样品进行检测，结果显示DAdV-B2 的阳性样品51份，阳性率为79.7%；有3 份DAdV-B1 检测弱阳性，阳性率为4.7%，无DAdV-B1 和DAdV-B2 混合感染病例，且与单一PCR 结果一致，符合率为100%（图5）。随机挑选6 份DAdV-B2 阳性样品及3 份DAdV-B1 阳性样品的PCR 产物测序，结果显示，DAdV-B2 阳性样品的fiber1 基因序列与CH-GD-12-2014 株相应基因的同源性为100%，DAdV-B1 阳性样品的序列与GR 株fiber 基因的同源性为100%。表明本研究建立的双重PCR 检测方法可用于临床样品的快速检测，且利用该方法本研究首次在国内发现番鸭DAdV-B1 感染。

图5 临床样品的双重PCR检测Fig.5 Duplex PCR test of clinical samples

3 讨 论

近年来我国番鸭中流行的白肝病病原是DAdVB2，鸭群中是否存在DAdV-B1 感染还不明了。因此建立DAdV-B1 和DAdV-B2 的鉴别检测方法，能够准确、快速对我国番鸭腺病毒感染情况进行调查，为防控该病提供科学依据，而国内外均未见DAdV-B1和DAdV-B2 的双重PCR 鉴别检测方法的报道。由于DAdV-B1 和DAdV-B2 分离株全基因组序列的同源性在90%以上，其编码的主要结构蛋白Hexon 和DNA 聚合酶同源性较高，不适合用于建立鉴别检测PCR 方法；DAdV-B1 仅有一个fiber 基因，与DAdV-B2 的两个fiber 基因（fiber1 和fiber2）的同源性均较低[6,8,10,12-13]。因此，本研究根据DAdV-B1 fiber 与DAdV-B2 fiber1基因的同源性差异，建立一种简便快速鉴别检测DAdV-B1 和DAdV-B2 的特异性双重PCR 方法。

根据DAdV-B1 GR 代表株[7]的fiber 基因和DAdVB2 分离株[8,10,13]的fiber1 基因序列特征，本研究团队前期预实验时分别设计了多对不同长度的引物，将特异性引物进行交叉组合，最终筛选PCR 扩增DAdVB1 fiber 188 bp 和DAdV-B2 fiber1 581 bp 的 两 对 最 适引物，本实验进一步经优化得到最佳退火温度为60.1 ℃，最适DAdV-B1 fiber 和DAdV-B2 fiber1 引物终浓度均为0.16 μmol/L。该PCR 扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中区分明显，便于结果判断。特异性实验也表明本研究建立的该双重PCR 方法除可检测到DAdV-B1 和DAdV-B2 外，对其他病原检测均为阴性，特异性较好。但由于本实验室未分离到DAdV-B1毒株，本研究建立的双重PCR检测方法不能对DAdVB1毒株进行敏感性测定，但是本研究建立的检测方法对DAdV-B1 fiber 和DAdV-B2 fiber1 质粒标准品的最低检测下限基本一致，推测本检测方法对这两种病毒的敏感性相同，且与万春和等[11]建立的DAdV-B2 fiber2 基因的PCR 检测方法的敏感性相当，表明本研究建立的双重PCR 检测方法的敏感性高。

番鸭白肝病是近年来在我国流行的一种新发疫病，除了病毒分离外，目前已经建立了DAdV-B2的常规PCR、qPCR、LAMP 等分子生物学检测方法[11,14-15]，也有检测DAdV-B2 fiber2 蛋白抗体的ELISA 方法[16]，但未见鉴别检测DAdV-B1 和DAdV-B2 的双重PCR 方法。所以本研究对实验室收集的64 份临床疑似感染DAdV 病死番鸭样品进行双重PCR 检测，并与单一PCR 检测结果进行比较，对阳性样品进行测序和同源性比较。结果显示，DAdV-B2 的检出率达79.7%，而DAdV-B1 的检出率低，仅4.7%，且没有DAdV-B1 和DAdV-B2 混合感染病例，表明我国2014 年以来在番鸭群中流行的白肝病的病原是DAdV-B2。同时，本研究在检测中首次发现国内DAdV-B1阳性病例，提示鸭腺病毒感染正趋复杂化。本研究建立的双重PCR检测方法为开展我国鸭腺病毒B 型感染的流行病学调查提供有效检测手段。