湖北拟酵母发酵制备甘露糖赤藓糖醇脂的研究

朱年青，贠雪，申小倩，徐佳慧，李泽宇，夏文静

（1.泰州学院，江苏 泰州 225300；2.南京师范大学泰州学院，江苏 泰州 225300）

甘露糖赤藓糖醇脂不仅具备作为表面活性剂优良的界面特性，而且还具有多功能的生物活性，如对人类白血病、大鼠嗜铬细胞瘤和小鼠黑色素瘤细胞的分化诱导；对不同的免疫球蛋白和凝集素也表现出很高的结合亲和力[1]。甘露糖赤藓糖醇脂（MELs）包含4-O-β-D-甘露糖基赤藓糖醇或1-O-β-D-甘露糖基赤藓糖醇作为亲水基团，脂肪酸作为疏水链，是由假丝酵母属菌株大量产生的功能性糖脂[2]。其中，A 型甘露糖赤藓糖醇脂和二乙酰化的甘露糖赤藓糖醇脂，能够提高阳离子脂质体介导的基因转移的效率。此外，甘露糖赤藓糖醇脂具有抗炎作用，能够抑制肥大细胞分泌炎症介质，这使得甘露糖赤藓糖醇脂在化妆品、医药等方面具有广泛应用价值。

甘露糖赤藓糖醇脂包括4 种不同的结构[3]。其中，A 型甘露糖赤藓糖醇脂中，甘露糖上含有2 个乙酰基，B 型甘露糖赤藓糖醇脂中，甘露糖上C-6 位含有1 个乙酰基，C 型甘露糖赤藓糖醇脂中，甘露糖上C-4 位含有1 个乙酰基，D 型甘露糖赤藓糖醇脂中甘露糖上不含乙酰基。甘露糖赤藓糖醇脂的界面性能和自组装性能的研究表明，分子结构（包括乙酰基的数量）的微小差异，会导致临界胶束浓度（CMC）的显著差异和液晶相的形成[4]。A 型甘露糖赤藓糖醇脂在处理水溶液方面存在缺陷，因为它的水溶性和亲水性很低，限制了其实际应用。另一方面，A 型甘露糖赤藓糖醇脂的脱乙酰衍生物B 型和C 型比A 型具有更高的亲水性和临界胶束浓度[5]，使得它们在油包水型乳化剂和/或洗涤剂中具有极大的优越性，在环保、日化、农业和医药等领域的应用受到广泛的关注。有关学者报道了非对映体B 型甘露糖赤藓糖醇脂的水相行为，其在非常宽的浓度和温度范围内自发组装成层状相，并在低浓度下形成相对较大的囊泡（1～5 μm）[6]。这些结果表明，非对映体B 型甘露糖赤藓糖醇脂作为囊泡形成脂质具有巨大的潜力，在药物和基因传递等方面有很大的应用需求。同时，由于中心位红糖醇部分的独特构型，非对映体糖脂表现出更优越的护肤性 能。

鉴于此，本文从三个方面研究湖北拟酵母发酵合成B 形甘露糖赤藓糖醇脂的影响因素，分别是：（1）橄榄油、玉米油、大豆油和花生油四种碳源对甘露糖赤藓糖醇脂产量的影响；（2）酵母提取物、麦芽提取物、玉米浸粉和蛋白胨四种有机氮源对甘露糖赤藓糖醇脂产量的影响；（3）在氮源总量不变的情况下，无机氮源硝酸钠与有机氮源酵母提取物之间的配比对甘露糖赤藓糖醇脂产量的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

湖北拟酵母（Pseudozyma Tsukubaensis）购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 培养基及摇瓶发酵

（1）YM 活化培养基（g/L）：麦芽汁提取物3.0、酵母提取物3.0、蛋白胨5.0、葡萄糖10.0、琼脂20.0。配制后121 ℃灭菌20 min，适温倒平板，无菌环境下操作。

（2）液体种子培养基（g/L）：酵母提取物3.0、麦芽汁提取物3.0、葡萄糖10.0、蛋白胨5.0、（pH 值6.0）。配制后按10 mL/瓶（100 mL 三角瓶）分装，121 ℃灭菌20 min。

（3）发酵培养基Ⅰ（g/L）：酵母提取物3.0、NaNO31.0、MgSO4·7H2O 0.30、KH2PO40.30、碳源种类和添加量根据试验设计进行，pH 值为6.0。按100 mL/瓶（500 mL 三角瓶）进行分装，121 ℃灭菌20 min。

（4）发酵培养基Ⅱ（g/L）：橄榄油120.0、NaNO31.0、MgSO4·7H2O 0.30、KH2PO40.30、有机氮源种类和添加量根据试验设计进行，（pH 值6.0）。按100 mL/瓶（500 mL 三角瓶）分装，121 ℃灭菌20 min。

将4 ℃斜面保藏的菌种通过平板划线法转接于YM 活化培养基上，25 ℃培养3 d；于平板上挑取单菌落于10 mL 液体种子培养基中，25 ℃、250 r/min条件下培养24 h；将种子培养液混匀，按照4%（V/ V）的接种量接种至发酵培养基中，于25 ℃、250 r/min条件下培养7 天。

1.2 实验设计

1.2.1 不同碳源植物油对湖北拟酵母合成MELs 的影响

选取橄榄油、玉米油、大豆油和花生油作为湖北拟酵母发酵培养基的的碳源，加入量为120 g/L，每组各设置3 个平行组。将活化好的菌种接种至发酵培养基Ⅰ中，对比发酵7 天后MELs 的产量。确定最优碳源后，将最优碳源分别按照40 g/L、80 g/L、120 g/L、200 g/L 的加入量添加至于发酵培养基Ⅰ中，并编号为A、B、C、D 组，每组各3 个平行组。对比发酵7 天后MELs 的产量。

1.2.2 不同有机氮源对湖北拟酵母合成MELs 的影响

实验分别选取酵母提取物、麦芽浸粉、玉米浸粉和蛋白胨作为湖北拟酵母发酵培养基的氮源，加入量均为3 g/L，并编号A、B、C、D 组，每组各设置3 个平行组。将活化好的菌种接种至发酵培养基Ⅱ中，对比发酵7 天后MELs 的生物合成产量。

确定最优氮源后，针对最优氮源分别按照1.0 g/ L、3.0 g/L、5.0 g/L、7.0 g/L 的加入量添加至发酵培养基Ⅱ中，并编号为A、B、C、D 组，每组各3 个平行组。对比发酵7 天后MELs 的产量。

1.2.3 氮源复配对湖北拟酵母合成MELs 的影响

为进一步研究无机氮源和有机氮源组合对MELs发酵的影响，将硝酸钠和酵母提取物进行了复配。保持氮源的总添加量不变，调整两种组分的含量，编号为A，B，C，D 和E，分别加入4.0 g/L 酵母提取物、3.0 g/L 酵母提取物+1.0 g/L NaNO3、2.0 g/L 酵母提取物+2.0 g/L NaNO3、1.0 g/L 酵母提取物+3.0 g/L NaNO3、4.0 g/L NaNO3。对比发酵7 天后MELs 的产量。

1.3 甘露糖赤藓糖醇脂定量分析

甘露糖赤藓糖醇脂利用Agilent 1100 HPLC检测。色谱柱型号为Inertsil SIL 100A（5 μm，4.6 mm×250 mm），检测器为蒸发光散射检测器。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对湖北拟酵母合成MELs 的影响

固定除碳源以外的其他成分，A 组、B 组、C 组、D 组分别加入等量的不同碳源物质，发酵7d 后，测定各组所产MELs 的量。结果如表1所示：四种碳源中，添加橄榄油为碳源时，MELs 产量最高，可达50 g/L，可能是橄榄油的脂肪酸的组成更适合MELs的合成。

表1 不同种类碳源对MELs 合成的影响Tab.1 Effects of different carbon sources on MELs production

橄榄油是最合适的碳源，继而进一步探究该碳源的最适加入量，在其他成分相同的情况下，A 组、B 组、C 组、D 组分别按照40 g/L、80 g/L、120 g/L、200 g/L 添加量，将橄榄油加入培养基中，发酵7d 后，测定各组MELs 产量。结果如表2所示：4 个浓度中，120 g/L 的橄榄油添加量最适合湖北拟酵母发酵生产MELs，产量可达52 g/L，当橄榄油浓度高于120 g/L，则会抑制菌株代谢油脂合成MELs。

表2 橄榄油浓度对MELs 合成的影响Tab.2 Effects of olive oil concentration on MELs production

2.2 不同氮源对湖北拟酵母合成MELs 的影响

固定除氮源以外的其他成分，A 组、B 组、C 组、D 组分别加入等量的不同的氮源物质，发酵7 d 后，测定各组所产MELs 的量。结果如表3所示：4 种氮源中，添加酵母提取物为氮源时，MELs 产量最高可达50 g/L，可见酵母提取物中的维生素、生长因子等成分能显著促进MELs 的合成。

表3 不同种类氮源对MELs 合成的影响Tab.3 Effects of different nitrogen sources on MELs production

通过实验设计发现酵母提取物是最合适的氮源，为进一步探究该氮源的最适加入量，在其他成分相同的情况下，A 组、B 组、C 组、D 组分别按照1.0 g/L、3.0 g/L、5.0 g/L、7.0 g/L 添加量，将酵母提取物加入培养基中，发酵7 d 后，测定各组MELs 产量。结果表4所示：4 个浓度中，3 g/L 的酵母提取物添加量最适合湖北拟酵母发酵生产MELs，产量可达52 g/L。

表4 酵母提取物浓度对MELs 合成的影响Tab.4 Effects of yeast extract concentration on MELs production

2.3 氮源复配对湖北拟酵母合成MELs 的影响

为进一步研究无机氮源和有机氮源组合对MELs发酵的影响，将硝酸钠和酵母提取物进行了复配。保持氮源的总添加量不变，对比A，B，C，D 和E 五个组合发酵7 天后MELs 的产量。结果如表5所示：当氮源配比为B 组合：1 g/L NaNO3+3 g/L 酵母提取物，即无机氮源/有机氮源=1/3 时，最适合湖北拟酵母发酵生产MELs，产量可达55 g/L。无机氮源有利于MELs 的合成，有机氮源有利于菌体的生长，当两种氮源比例合适时，菌株才能够生长并高效合成MELs。

表5 不同氮源复配比例对MELs 合成的影响Tab.5 Effects of different ratios of nitrogen sources on MELs production

3 结论与讨论

本研究以湖北拟酵母为发酵菌株，探究不同碳源、有机氮源及二者的添加量对微生物合成MELs 的影响。结果表明碳源中橄榄油更有利于湖北拟酵母发酵合成MELs，而有机氮源中酵母提取物更有利于湖北拟酵母发酵合成MELs。在选取硝酸钠和酵母提取粉进行复配的实验中发现：以3.0 g/L 酵母提取物和1.0 g/L 硝酸钠组合时，最适合于湖北拟酵母发酵合成MELs。湖北拟酵母发酵合成MELs 的最优培养基组成成分为：橄榄油120 g/L、酵母提取物3.0 g/ L、NaNO31.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.30 g/L、KH2PO40.30 g/ L，此条件下湖北拟酵母发酵7 d 后MELs 产量可达55 g/L。